3 種醫院外用制劑微生物限度檢查方法的建立*

鄧 莉，陳勇川，胡 斌，馬 攀，胡 婧

（中國人民解放軍陸軍軍醫大學第一附屬醫院藥劑科，重慶 400038）

醫院制劑主要是針對本院臨床需要且需求量小、不適合工廠批量生產的品種，控制其質量是保證臨床安全用藥的前提。對藥品的微生物進行控制是控制藥品質量的一項重要檢查項目［1］，也是保障制劑安全性的重要組成部分。尿素軟膏、維生素E 乳膏、復方苯甲酸軟膏均為我院院內制劑，療效確切，臨床應用廣泛。為控制其質量，保證檢測方法的可靠性和準確性，確保其微生物限度達到要求［2］，本研究中參考文獻［3-8］，按2015 年版《中國藥典（四部）》通則1105，1106，1107 項下要求［9］，通過試驗驗證，建立了3 種外用制劑微生物限度的檢查方法。現報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo Scientific-1381 A2 型生物安全柜（美國Thermo 公司）；TB124S 型分析天平（梅特勒托利多儀器＜上海＞有限公司，精度為百分之一）；LRH-150F 型生化培養箱（重慶四達實驗儀器公司）；MJ-180-Ⅱ型霉菌培養箱（上海躍進醫療器械有限公司）；LDZF-30KB-Ⅱ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）。

1.2 材料

試藥：復方苯甲酸軟膏（批號為180226，規格為每盒18 g），維生素E 乳膏（批號為180130，規格為每支50 g），尿素軟膏（批號為180108，規格為每盒18 g），均由陸軍軍醫大學第一附屬醫院藥劑科提供。

培養基：胰酪大豆胨液體培養基（批號為1703022），胰酪大豆胨瓊脂培養基（批號為1706262），沙氏葡萄糖瓊脂培養基（批號為1702134），甘露醇氯化鈉瓊脂培養基（批號為170104），溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養基（批號為170103），均由北京三藥科技開發公司提供。

菌種：銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］，枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］，金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］，黑曲霉［CMCC（F）98003］，白色念珠菌［CMCC（F）98001］，大腸埃希菌［CMCC（B）44102］，均由中國食品藥品檢定研究院提供。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 菌液制備

按2015 年版《中國藥典（四部）》通則1105 項下方法制備菌液。

2.1.2 供試液制備

尿素軟膏供試液：取尿素軟膏10 g，加入含無菌十四烷酸異丙酯20 mL 和無菌玻璃珠的三角瓶中，振搖，混勻，再加入pH 7.0 的45 ℃無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL，振搖，混勻，靜置，待油水明顯分層，取水層，作為1 ∶10 的供試液。

維生素E 乳膏供試液［10］：取維生素E 乳膏10 g，加入pH 7.0 的45 ℃無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL，振搖，混勻，作為1 ∶10 的供試液。取20 mL 1 ∶10 的供試液，加入pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL，搖勻，制成1 ∶50 的供試液。

復方苯甲酸軟膏供試液：方法一，取復方苯甲酸軟膏10 g，加入含20 mL 無菌十四烷酸異丙酯和無菌玻璃珠的三角瓶中，振搖，混勻，加入pH 7.0 的45 ℃無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL，振搖，混勻，靜置，待油水分層，取水層，作為1 ∶10 的供試液；取1 ∶10 的供試液10 mL，加入pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL，搖勻，制成1 ∶100 的供試液。方法二，取復方苯甲酸軟膏10 g，加入含無菌十四烷酸異丙酯20 mL 和無菌玻璃珠的三角瓶中，充分振搖，混勻，加入11 mL 的1 mol/L 無菌氫氧化鈉溶液，再加45 ℃的pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液89 mL，振搖，混勻，靜置，待油水分層明顯，取水層，作為1 ∶10 的供試液；進一步稀釋為1 ∶100 的供試液。

2.2 需氧菌、霉菌和酵母菌總數計數方法適用性試驗

試驗組［11-12］：取2.1.2 項下尿素軟膏1 ∶10 供試液、維生素E 乳膏1 ∶10 供試液和1 ∶50 供試液各9.9 mL，2.1.2 項下復方苯甲酸軟膏方法一中1 ∶100供試液和方法二中1 ∶100 供試液9.9 mL，各5 份，每份分別加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌及黑曲霉菌菌懸液各0.1 mL，使供試液每1 mL 含菌數不大于100 cfu，混勻，吸取各染菌供試液1 mL，注入平皿，每份平行制備2 個平皿，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基，置35 ℃培養3 d，測定需氧菌總數。取2.1.2 項下尿素軟膏、維生素E 乳膏1 ∶10 供試液9.9 mL，復方苯甲酸軟膏方法一中1 ∶100 供試液和方法二中1 ∶100 供試液9.9 mL，各2 份，分別加入白色念珠菌和黑曲霉菌懸液各0.1 mL，使供試液每1 mL 含菌數不大于100 cfu，混勻，吸取各染菌供試液1 mL 注入平皿，平行制備2 個平皿，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基，置25 ℃培養5 d，測定霉菌及酵母菌總數。

菌液對照組：用稀釋液代替供試液，同試驗組操作。

供試品組：用稀釋液代替菌液，同試驗組操作。

稀釋劑組：用稀釋液代替供試液、菌液，同試驗組操作。

回收率：試驗組菌比值=（試驗組平均菌落數-供試品組的平均菌落數）/菌液對照組的平均菌落數。霉菌和酵母菌總數見表1，需氧菌總數驗證試驗結果見表2。

驗證結果：按2015 年版《中國藥典（四部）》通則1105 微生物計數法進行驗證，做3 次平行試驗。需氧菌總數檢查，尿素軟膏采用常規法，維生素E 乳膏采用培養基稀釋法，復方苯甲酸軟膏采用中和法和培養基稀釋法聯用，5 種試驗菌回收率比值均在0.5～2.0 范圍內；霉菌及酵母菌總數檢查，尿素軟膏、維生素E 乳膏采用常規法、復方苯甲酸軟膏可用中和法和培養基稀釋法聯用，2 種試驗菌回收率比值均在0.5～2.0 范圍內。結果均符合藥典規定。

表1 霉菌和酵母菌回收率比值

表2 需氧菌總數回收率比值

2.3 控制菌檢查方法適用性試驗

2.3.1 金黃色葡萄球菌

試驗組：取2.1.2 項下1 ∶10 尿素軟膏、維生素E乳膏供試液各10 mL 及含菌量不大于100 cfu 的金黃色葡萄球菌，同時分別接種至100 mL 胰酪大豆胨液體培養基中，混勻；取2.1.2 項下復方苯甲酸軟膏方法二中1 ∶10 供試液10 mL 及含菌量不大于100 cfu 的金黃色葡萄球菌，同時接種至200 mL 胰酪大豆胨液體培養基中，混勻，35 ℃培養24 h，觀察結果。菌液對照組：用稀釋液代替供試液，同試驗組操作。供試品組：用稀釋液代替菌液，同試驗組操作。

稀釋劑組：用稀釋液代替供試液、菌液，同試驗組操作。驗證結果：結果見表3。

2.3.2 銅綠假單胞菌

試驗組：取2.1.2 項下1 ∶10 尿素軟膏、維生素E乳膏供試液各10 mL 及含菌量不大于100 cfu 的銅綠假單胞菌菌懸液，同時分別接種至100 mL 胰酪大豆胨液體培養基中，混勻；取2.1.2 項下復方苯甲酸軟膏方法二中1 ∶10 供試液10 mL 及含菌量不大于100 cfu 的銅綠假單胞菌菌懸液，同時接種至200 mL 胰酪大豆胨液體培養基中，混勻，35 ℃培養24 h，觀察結果。

菌液對照組：用稀釋液代替供試液，同試驗組操作。

供試品組：用稀釋液代替菌液，同試驗組操作。

稀釋劑組：用稀釋液代替供試液、菌液，同試驗組操作。

驗證結果：結果見表3。可見，控制菌檢查中，尿素軟膏、維生素E 乳膏采用常規法，試驗組相應陽性菌能正常檢出。復方苯甲酸軟膏采用中和法加稀釋法，試驗組相應陽性菌均能正常檢出。

3 討論

不同醫院配制的制劑，即使名稱相同，由于采用的工藝和輔料等不同，制劑仍可能表現出不同的抑菌特性，故微生物限度檢查方法不能簡單復制［13］，需經各單位針對各制劑進行方法學驗證。在對醫院制劑的方法驗證活動中應遵從“就簡不就繁”，盡量按常規法、培養基稀釋法，或考慮培養基稀釋法與中和法聯用，最后采取薄膜過濾法的順序進行。

本研究結果顯示，尿素軟膏的微生物限度檢查方法為需氧菌總數檢查、霉菌和酵母菌總數檢查、控制菌檢查，均可采用常規法；維生素E 乳膏的微生物限度檢查方法為需氧菌總數檢查，可采用稀釋法（1 ∶50），霉菌和酵母菌總數檢查可采用常規法，控制菌檢查均可采用常規法；復方苯甲酸軟膏的微生物限度檢查方法為需氧菌總數檢查、霉菌和酵母菌總數檢查，可采用中和法加稀釋法（2.1.2 項下復方苯甲酸軟膏方法二1 ∶100），控制菌檢查均可采用中和法加稀釋法，取2.1.2 項下復方苯甲酸軟膏方法二1 ∶10 供試液加入不少于200 mL胰酪大豆胨液體培養基中。

在建立這3 個制劑的方法驗證時，開始都采用無菌十四烷酸異丙酯萃取，結果軟膏較理想，油相和水相分層較清晰。而乳膏萃取時不能很好地分散，經比較，最終確定的樣品分散方法為：樣品10 g，加恒溫45 ℃的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL。

3 個制劑中，尿素軟膏具有抗菌、止癢等作用，在驗證中采用常規法，回收率比值為0.5～2.0，方法準確、可靠；維生素E 為維生素類藥物，其并無抑菌作用，由于配方中加入了布羅波爾防腐劑，用常規法無法消除其抑菌性，采用1 ∶50 的稀釋法能使回收率比值為0.5～2.0，消除了其抑菌成分；在對復方苯甲酸軟膏的驗證時，最初采用了1 ∶10 和1 ∶100 的稀釋法，5 種菌株均未見生長。苯甲酸、水楊酸均有抗細菌、真菌作用。苯甲酸在酸性環境中抑菌作用強，在堿性環境下作用減弱，兩者配伍應用可增強抗菌作用［14］。測得1 ∶10 供試液pH為3.5，后考慮酸堿中和法，改變溶液pH 來排除苯甲酸和水楊酸對微生物限度檢查結果的干擾。經試驗得出中和劑的量為11 mL 的1 mol /L 無菌氫氧化鈉溶液，可調節1 ∶10 供試液的pH 至6～8，同時采用測試菌株對中和劑進行了回收試驗，回收率比值均為0.5～2.0。表明此中和劑和中和產物的有效性及對微生物的無毒性可滿足試驗的要求，可消除該制劑中抑菌成分的干擾，可確保方法的科學性和檢查結果的準確性。