豁痰通絡方對大鼠球囊損傷內膜增生ERK/JNK信號轉導通路的干預機制

沈娟娟 褚穎 蘇穎 胡亞男 聶金娜 路方平 王利鋒 馬金玲 王聞婧 田野

(長春中醫藥大學，吉林 長春 130117)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)是中老年人群高發疾病，介入治療是主要治療方法，但血管成形術后再狹窄的發病率不斷增高，危害中老年患者健康，影響其治療遠期預后及人們的生活質量。血管再狹窄問題成為研究心血管領域的難點〔1,2〕。血管再狹窄進程中，血管平滑肌細胞異常增殖，新生內膜增厚是主要的環節〔3〕。多種因素刺激血管平滑肌細胞，多種細胞外信號轉導通路被激活，從而影響細胞生長周期，引起血管平滑肌細胞增殖、轉移及凋亡。在多種細胞外信號轉導通路中，調節氨基末端蛋白激酶(JNK)、蛋白激酶(ERK)、p38 絲裂素活化蛋白激酶(p38 MAPK)信號通路被激活后，其調控作用顯著〔4〕。所以干預血管平滑肌細胞增殖及凋亡相關調控信號轉導通路成為影響經皮冠狀動脈腔內血管成形術(PTCA)后再狹窄防治的重要切入點〔5,6〕。心脈痹阻成為冠心病主要病因病機，結合“心主血脈”理論，明確在血管重建術后再狹窄這個復雜的病理過程中，氣滯、血瘀、痰濁、熱毒四者互結是其主要的病機關鍵〔1〕。根據“心主血脈”理論，是否可以通過調節心之氣血陰陽，從痰瘀伏絡，蘊結成毒角度論治血管重建術后再狹窄，為解決冠心病血管重建術后再狹窄問題提供新思路。本文擬分析豁瘀通絡方對大鼠球囊損傷內膜增生ERK/JNK信號轉導通路的干預機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 ①實驗動物：北京維通利華實驗動物技術有限公司提供SPF級雄性大鼠60只，動物合格證號：SCXK(京)2012-0001。②實驗試劑：豁痰通絡方(申請專利，保密)，長春中醫藥大學提供，生藥含量2.33 g/ml。辛伐他汀片，遠大醫藥中國有限公司，批號：H20000107。③實驗器材：水平電泳儀(北京六一有限公司，DYCP-31CN)；數顯翹板脫色搖床電泳(上海力辰邦西儀器科技有限公司，RS 1)；數顯臺式恒溫搖床振蕩器(上海助藍儀器科技有限公司)〔1〕。

1.2制備模型 SD大鼠術前皮注低分子肝素鈉抗凝1 h后進行造模〔7〕。麻醉大鼠后于左頸總動脈行球囊損傷術，術后給予青霉素及低分子肝素鈉注射液進行抗炎、抗凝。假手術組不進行球囊損傷，只結扎左頸總動脈。

1.3實驗分組 SD大鼠隨機分為6組，其中假手術組、模型組給予蒸溜水灌胃，豁痰通絡組給予1.633 g/ml灌胃；辛伐他汀組給予0.119 mg/ml灌胃；豁痰通絡+辛伐他汀組給予中藥組方1.633 g/ml、辛伐他汀0.119 mg/ml灌胃，術后次日灌胃給藥，連續30 d。以上藥物均按1 ml/kg體重配制給藥。

1.4蘇木素-伊紅(HE)染色法檢測大鼠頸動脈內膜增生 將石蠟常規包埋后，切片烘干常溫保存備用。采用常規脫蠟、染色、脫水、封片。

1.5免疫組化染色法 根據免疫組化試劑盒說明常規操作(ERK 抗體效價1∶100)。免疫組化圖像分析：棕黃色染色為陽性反應。ERK在胞質和胞核中表達。

1.6RT-PCR檢測實驗 取適量標本，充分研磨。常規提取總RNA，測定RNA濃度，進行逆轉錄反應，后進行PCR反應測定。白細胞介素(IL)-1β引物、正義：5′-CTC ATT GTG GCT GTG GAG AA-3′，反義：5′-GGG ATT TTG TCG TTG CTT GT-3′，特異性擴增片段為323 bp。IL-6引物：正義：5′-CAC AGA GGA TAC CAC CCA CA-3′，反義：5′-GAA CTC CAG AAG ACC AGA GCA-3′，特異性擴增片段為256 bp。β-actin引物，正義：5′-GCC GTC TTC CCC TCC ATC GTG-3′，反義：5′-TAC GAC CAG AGG CAT ACA GGG ACA AC-3′，特異性擴增片段為357 bp。PCR條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s；IL-1β退火溫度為 55.7℃；IL-6退火溫度為 58.8℃；β-actin退火溫度為60℃，退火30 s； 72℃延伸45 s；72℃最后延伸7 min；共35個循環。進行凝膠電泳后用AlphaImager EP凝膠成像儀分析系統進行拍照和灰度分析。

1.7Western印跡實驗 取凍存于液氮的血管標本，總蛋白提取后采用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定濃度，配制10%分離膠，5%濃縮膠，設置恒壓80 V，30 min后將電壓設置為120 V(恒壓)，90 min結束電泳。轉膜設置恒定電流 400 mA，轉膜90 min。采用脫脂奶粉進行室溫封閉 120 min，加入一抗，p-ERK、p-p38、p-JNK1/2。25℃水浴箱中震蕩孵育1 h后4 ℃過夜。二抗孵育按1∶400比例于25℃水浴箱中孵育2 h。應用Quaniityone凝膠圖像分析計算積分光密度，以p-ERK、p-p38、p-JNK1/2蛋白與內參照β-actin蛋白積分光密度的比值表示p-ERK、p-p38、p-JNK1/2蛋白的相對含量。

1.8統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1HE染色法檢測大鼠頸動脈內膜增生 模型組內膜明顯增厚，平滑肌細胞排列紊亂顯著增生，表明模型已經形成；與模型組比較，辛伐他汀組動物內膜增生顯著緩解，豁痰通絡組內膜增生減輕仍見排列紊亂；豁痰通絡+辛伐他汀組動脈內膜增生顯著減輕。見圖1。

2.2免疫組化染色結果 在細胞質內可見p-ERK表達，活化后進入細胞核。細胞核見棕黃色，并見沉積的棕黃色顆粒為陽性反應。模型組可見明顯棕黃色細胞核，豁痰通絡、辛伐他汀組、豁痰通絡+辛伐他汀組陽性著色與模型組比較顯著改善。見圖2。

圖1 HE法檢測血管內膜增生情況(HE，×100)

圖2 免疫組化染色法檢測血管ERK蛋白表達(DAB，×50)

2.3RT-PCR檢測實驗結果 與假手術組比較，IL-1β mRNA表達在模型組中極顯著增高(P<0.01)，與模型組比較，豁痰通絡組顯著減少(P<0.05)，辛伐他汀組、豁痰通絡+辛伐他汀組極顯著減少(P<0.01)，與假手術組比較，IL-6 mRNA表達在模型組中極顯著增高(P<0.01)，與模型組比較，豁痰通絡、辛伐他汀組顯著減少(P<0.05)，豁痰通絡+辛伐他汀組極顯著減少(P<0.01)，見表1，圖3，圖4。

表1 各組頸靜脈組織IL-1β、IL-6 mRNA比較

1.假手術組；2.模型組；3.豁痰通絡組；4.辛伐他汀組；5.豁痰通絡+辛伐他汀組；下圖同圖3 RT-PCR檢測IL-1β mRNA的表達

圖4 RT-PCR檢測IL-6 mRNA的表達

2.4Western印跡實驗結果 對比模型組，豁痰通絡組、辛伐他汀組均能夠顯著降低p-ERK1/2蛋白表達(P<0.05)，豁痰通絡+辛伐他汀組較模型組比較極顯著降低p-ERK1/2蛋白表達(P<0.01)。豁痰通絡組、辛伐他汀組、豁痰通絡+辛伐他汀組較模型組比較均能極顯著降低p-p38、p-JNK1/2蛋白表達(P<0.01，P<0.05)。見表2，圖5。

表2 各組頸靜脈組織ERK1/2、P38、和JNK1/2蛋白表達比較

圖5 各組ERK1/2、P38、JNK1/2蛋白表達

3 討 論

血管內皮細胞在正常狀態下排列緊密連續，能夠通過有效抑制脂質堆積及炎癥浸潤，分泌抗凝血因子，起到抗血栓形成的作用〔8〕，血管成形術容易損傷血管內皮細胞，血管內膜被撕脫損傷，影響血管內皮細胞正常功能，出現過度自我修復及增殖，減少抗血栓形成因子的分泌，聚集激活血小板后，再次形成血栓〔9〕。經血管造影檢測顯示，多數患者存在血管再狹窄的風險。

3.1影響血管再狹窄形成的因素 基礎因素：年齡，老年人群為此病證的高發群體，其血管彈性伴隨著年齡增長呈下降趨勢，血管內皮細胞失去連貫性，直接影響內皮細胞的正常功能，再生內皮細胞功能不穩定成熟，是血管再狹窄發生的年齡因素〔10〕。吸煙及肥胖可以加速冠狀動脈粥樣硬化的發展進程，也是血管再狹窄發生的重要影響因素。基礎疾病例如糖尿病患者，血糖水平控制不佳直接影響血管再狹窄的發生發展〔11〕。炎癥介質因素：炎癥細胞被激活，與血管再狹窄的發生發展呈正相關作用，在血管內膜被機械損傷后，影響血管內皮細胞功能，內皮細胞分泌黏附因子，促使白細胞被活化，白細胞聯合內皮細胞促進趨化因子及炎癥因子過度產生，導致內皮細胞過度增殖，引發血管重塑，進一步促進血管在狹窄的發生〔12〕。腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1及IL-6等細胞炎癥因子可以和受體結合，活化細胞外多種信號轉導通路〔13〕，例如ERK信號轉導通路，ERK激活后磷酸化的ERK1/2再激活轉錄因子，能夠刺激血管平滑肌細胞增殖并遷移，如此產生惡性循環效應，對血管再狹窄起到重要作用〔14〕。

血管內膜被機械損傷后，內皮細胞出現一系列變化，其中內皮生長因子、G蛋白受體、內皮面縛因子等活化后刺激細胞，激活細胞外多種信號轉導通路，這些信號轉導通路構成了復雜的網絡，能夠誘導內皮細胞增殖、遷移，釋放血管緊張素-Ⅱ，且能夠誘導細胞內的炎癥反應〔15〕。

例如MAPK家族，其成員主要包括JNK、ERK1/2、p38及ERK5信號轉導通路〔16〕。MAPK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要存在于細胞內。MAPK可以將信號從細胞表面傳遞到細胞核，把細胞外信號傳遞到細胞內，對細胞的基因轉錄有非常重要的調控作用，影響細胞生長周期，導致細胞過度增殖、分化及遷移〔17〕。在MAPK家族中，最為經典的信號轉導通路為JNK、ERK1/2、p38信號轉導通路〔18〕。如果受到外界刺激，例如生長因子、細胞因子、滲透壓等因素激活了JNK、ERK1/2、p38信號轉導通路，使細胞內ERK/JNK的蛋白表達改變，活化后的ERK由細胞表面傳導至細胞核，而JNK活化后將下游底物JNK等磷酸化，活化后的ERK/JNK對細胞增殖、生長、分化、遷移及凋亡等方面有重要的調節作用〔19〕。其中JNK對細胞的增殖、遷移及凋亡具有促進作用，而ERK1/2可以調控細胞的增殖遷移及凋亡，發揮保護作用〔20〕。

本研究發現，豁痰通絡方可使內膜增生成度顯著降低，并能夠減少頸動脈組織中p-ERK1/2、p-p38、p-JNK1/2的蛋白表達。闡明中藥豁痰通絡飲能夠減少球囊損傷后大鼠頸動脈血管炎癥反應，抑制血管內皮增生。可能與抑制 ERK1/2、p38、JNK1/2信號通路相關。

3.2中醫學理論認識血管再狹窄 中醫學認為“心痛”“胸痹”等病證可以概括冠心病、心絞痛的理論范疇，其“心脈閉阻不通”是發病的重要機制〔21〕。中醫認為“術后必傷氣”、“術后必有瘀”〔22〕。氣為血之帥，血為氣之母，氣虛無力推動血的運行，血行不暢，無力滋養人體，且日久易出現氣滯血瘀，瘀血內阻，氣機被阻滯，失于條達；進而影響津液輸布，津液停聚成痰，痰濕阻滯氣血運行，日久蘊結成為熱毒。血管重建術是現今西醫普遍應用的冠心病、心肌梗死的急救方案。因血管重建術會損傷血管內皮，形成血栓〔23〕，再次形成瘀血。瘀血阻遏氣機運行，不能化氣行水，津液內停形成痰飲，痰濕日久蘊結成為熱毒。形成了氣滯、血瘀、痰濁、熱毒，四者又互為因果，久留不去，伏藏與人體臟腑中，若有內外因素干擾，必至血脈再次瘀阻〔24〕。

以上理論均體現伏邪致病的特點，伏邪潛藏于人體臟腑內，若人體正氣充足，則不易體現〔25〕。血管重建術后患者大都病程較長，人體正氣已經虧虛，如若收到內外因素干擾，例如感受四時不正之氣，或情志刺激，勞倦過度，飲食失節等因素干擾，則易新感引動伏邪，必再次發病，并且病情進一步加重。