miR-378c靶向AKT1調控骨關節炎軟骨細胞增殖、凋亡的機制

張健博 宋建鋒 武海發

(永煤集團總醫院骨科，河南 永城 476600)

骨關節炎(OA)是一種由遺傳、機械和環境等多因素引起的復雜關節退行性病變，臨其床表現主要為緩慢發展的關節疼痛、壓痛、僵硬、關節腫脹、活動受限和關節畸形等〔1〕。OA的發病機制復雜，軟骨細胞的異常凋亡，導致軟骨的完整性破壞，負重功能及骨損傷、重塑平衡功能的喪失可能是其發生的主要原因〔2〕。因此，如何維持軟骨細胞增殖和凋亡的動態平衡是防治OA的關鍵環節。蛋白激酶B(AKT)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在調控細胞存活和凋亡中起重要作用〔3〕。有研究〔4〕發現，AKT參與關節炎的病理過程，磷酸化(p)-AKT在骨關節炎軟骨細胞中表達下調。黃連素可通過激活AKT促進骨關節炎軟骨細胞的存活〔5〕。miR-378c是miR-378家族的主要成員，荊琳等〔6〕在研究膝骨關節炎患者軟骨組織與血漿中miRNA表達變化及意義時發現，miR-378c在OA軟骨組織中表達上調，但miR-378c對骨關節炎軟骨細胞的增殖和凋亡的影響及miR-378c能否介導AKT1表達參與調控OA軟骨細胞的增殖和凋亡尚未可知。因此，本研究通過檢測miR-378c和p-AKT1在正常軟骨組織和OA軟骨組織中的表達差異，探討miR-378c靶向AKT1對OA軟骨細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料與主要試劑、儀器 18例OA軟骨組織和18例正常軟骨組織由永煤集團總醫院骨科于2017年1月至2018年1月收集。成人OA-軟骨細胞HC-OA購于處實(上海)生物科技有限公司。DMEM/F12和胎牛血清(FBS)購于Thermo公司；LipofectamineTM 2000相關轉染試劑和TRIzol試劑購于美國Invitrogen公司；RT-PCR引物、miR-378c抑制物(anti-miR-378c)、miRNA抑制物陽性對照(anti-miR-NC)、小干擾RNA無序陽性對照(si-NC)、AKT1小干擾RNA(si-AKT1)、野生型(WT)-AKT1及突變型(MUT)-AKT1的構建和測序由上海生工公司提供；噻唑藍(MTT)試劑、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、Western印跡相關試劑購于北京索萊寶公司；p-AKT1、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、細胞周期素(Cyclin)D1、P21、Bax和Bcl-2一抗購于Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗和RIPA裂解液購于上海生工公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于美國Promega公司；SYBR Green PCR試劑盒購于TaKaRa；酶標儀和LightCycler 480實時熒光定量PCR儀購自美國Thermo公司；流式細胞儀購自美國Beckman公司。

1.2細胞培養與轉染 采用DMEM/F12培養基(含有10% FBS)在37℃、CO2體積分數5%的培養條件下培養人OA軟骨細胞HC-OA，每隔1 d更換液1次，當細胞融合率達到80%時，用胰酶消化后進行傳代。細胞轉染：取對數期生長良好的HC-OA細胞，調整細胞濃度，以2×105個/孔細胞數接種于96孔培養板，當細胞融合度達到50%時，利用LipofectamineTM2000將anti-miR-378c、anti-miR-NC、si-NC和si-AKT1分別轉染H9c2細胞，于細胞培養箱常規培養24 h后，進行后續實驗分析。實驗分組如下：anti-miR-378c組(轉染anti-miR-378c)、anti-miR-NC組(轉染anti-miR-NC)、si-NC組(轉染si-NC)、si-AKT1組(轉染si-AKT1)、anti-miR-378c+si-NC組(轉染anti-miR-378c和si-NC)和anti-miR-378c+si-AKT1組(轉染anti-miR-378c和si-AKT1)。

1.3qRT-PCR檢測 按照TRIzol試劑使用說明從18例正常軟骨組織和18例OA軟骨組織及各組HC-OA細胞中提取總RNA，逆轉錄為cDNA后，用SYBR Green PCR試劑盒進行RT-PCR反應，用LightCycler 480系統進行信號收集熒光信號并進行熔爐曲線分析。以U6作為miR-378c和p-AKT1 mRNA的內參，用2-ΔΔCt方法計算miR-378c和p-AKT1 mRNA的相對表達量。

1.4MTT實驗檢測細胞增殖活力 取轉染24 h的HC-OA細胞，以細胞密度為1×104個/孔接種于96孔板進行培養。分別在培養24 h、48 h、72 h時向每個孔中加入20 μl的MTT試劑，室溫反應4 h，吸去孔內上清液，每孔再加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，緩慢搖動10 min至完全溶解。用酶標儀在490 nm波長處檢測各孔的OD值(以空白孔進行調零)。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡 取各組HC-OA細胞，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化后離心，棄上清收集各組細胞，用預冷的1×磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗細胞，加入適量的1×結合緩沖液輕輕吹打重懸細胞，然后加入5 μl的膜聯蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)混勻，室溫避光孵育15 min后，加入5 μl的碘化丙啶(PI)染色，隨后用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.6雙熒光素酶報告基因檢測 利用靶基因預測數據庫Targetscan網站(http：//www.targetscan.org/vert/)預測miR-378c的靶基因。發現miR-378c的5′端可與AKT1的3′-UTR特異性結合，猜測AKT1是miR-378c的靶基因。為驗證這一猜想，構建WT-AKT1和MUT-AKT1的AKT13′-UTR熒光素酶報告載體。利用LipofectamineTM 2000將miR-378c和miR-NC分別與WT-AKT1和MUT-AKT1共轉染HC-OA細胞，然后將各組HC-OA細胞于細胞培養箱內培養48 h，收集各組細胞，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書對各組HC-OA細胞的熒光素酶活性進行檢測。

1.7Western印跡檢測 按照用RIPA裂解液使用說明書裂解各組HC-OA細胞和正常軟骨組織和OA軟骨組織，收集細胞總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白，將蛋白轉至PVDF膜上，用洗滌液洗膜后加入封閉液室溫封閉1 h，吸盡封閉液，加入相應的抗p-AKT1、GAPDH、CyclinD1、P21、Bax和Bcl-2一抗(1：1 000)4℃孵育過夜，用洗滌液洗膜3次，每次10 min，隨后加入稀釋好的HRP標記的二抗(1：1 000)室溫孵育2 h，再次洗膜3次后于暗室加入顯影液進行顯色并拍照，用凝膠圖像處理系統分析目標帶光密度值(以GAPDH作為內參)。

1.8數據處理 采用統計學軟件SPSS20.0進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1miR-378c、AKT1在OA患者軟骨組織和健康人正常軟骨組織中的表達 與正常軟骨組織相比，OA軟骨組織中miR-378c表達顯著升高，p-AKT1蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 軟骨組織p-AKT1蛋白的表達

表1 miR-378c、AKT1在OA軟骨組織和正常軟骨組織中的表達

2.2抑制miR-378c表達對HC-OA細胞增殖的影響 anti-miR-378c組中miR-378c的表達顯著低于anti-miR-NC組(P<0.05)，表明成功構建了抑制miR-378c表達的HC-OA細胞株。與anti-miR-NC組相比，anti-miR-378c組中HC-OA細胞在24 h、48 h、72 h時的細胞活力顯著升高，CyclinD1蛋白的表達顯著升高，P21蛋白的表達顯著減低(P<0.05)。見圖2、表2。

2.3抑制miR-378c表達對HC-OA細胞凋亡的影響 與anti-miR-NC組相比，anti-miR-378c組HC-OA細胞凋亡率顯著降低，Bax蛋白的表達顯著降低，Bcl-2蛋白的表達顯著升高(P<0.05)。見圖3、圖4、表3。

圖2 抑制miR-378c表達對HC-OA細胞增殖蛋白表達的影響

表2 抑制miR-378c表達對HC-OA細胞增殖的影響

圖3 抑制miR-378c表達對HC-OA細胞凋亡率影響

圖4 抑制miR-378c表達對HC-OA細胞凋亡蛋白表達的影響

表3 抑制miR-378c表達對HC-OA細胞凋亡的影響

2.4miR-378c靶向調控AKT1 miR-378c與WT-AKT1的3′UTR之間存在特異性結合位點見圖5。野生型AKT1基因熒光素酶表達載體WT-AKT1和miR-378c mimics共轉染HC-OA細胞后，miR-378c組HC-OA細胞熒光素酶活性較再轉染miR-NC組明顯降低(P<0.05)；而突變型AKT1基因熒光素酶表達載體MUT-AKT1和miR-378c mimics共轉染HC-OA細胞后，miR-378c組HC-OA細胞熒光素酶活性較再轉染miR-NC組差異不顯著(P>0.05)。見表4。與miR-NC組比較，miR-378c組HC-OA細胞p-AKT1 mRNA 和p-AKT1蛋白的表達量顯著減低；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-378c組HC-OA細胞p-AKT1 mRNA和p-AKT1蛋白的表達量顯著升高(P<0.05)。見圖6、表5。

圖5 AKT1的3′UTR含有miR-378c的互補序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

1～4:miR-NC組、miR-378c組、anti-miR-NC組、anti-miR-378c組圖6 各組p-AKT1蛋白的表達

表5 miR-378c調控AKT1的表達

2.5干擾AKT1的表達能逆轉抑制miR-378c表達對HC-OA細胞增殖的促進作用 與anti-miR-NC組比較，anti-miR-378c組HC-OA細胞在24 h、48 h、72 h時的細胞活力顯著升高，p-AKT1和CyclinD1蛋白的表達顯著升高，P21蛋白的表達顯著減低；與anti-miR-378c+si-NC組比較，anti-miR-378c+si-AKT1組HC-OA細胞在24 h、48 h、72 h時的細胞活力顯著降低，p-AKT1和CyclinD1蛋白的表達顯著降低，P21蛋白的表達顯著升高(P<0.05)。見圖7、表6。

1～4：anti-miR-NC組、anti-miR-378c組、anti-miR-378c+si-NC組、anti-miR-378c+si-AKT1組；下圖同圖7 p-AKT1及增殖蛋白的表達

表6 干擾AKT1的表達能逆轉抑制miR-378c表達對HC-OA細胞增殖的作用

2.6干擾AKT1的表達能逆轉抑制miR-378c表達對HC-OA細胞凋亡的抑制作用 與anti-miR-NC組比較，anti-miR-378c組HC-OA細胞的凋亡率顯著降低，Bax蛋白的表達顯著降低，Bcl-2蛋白的表達顯著升高；與anti-miR-378c+si-NC組比較，anti-miR-378c+si-AKT1組HC-OA細胞的凋亡率顯著升高，Bax蛋白的表達顯著升高，Bcl-2蛋白的表達顯著降低。見圖8、表7。

圖8 凋亡蛋白的表達

表7 干擾AKT1的表達能逆轉抑制miR-378c表達對HC-OA細胞凋亡的抑制作用

3 討 論

AKT激酶家族包括AKT1、AKT2和AKT3 3個成員，與磷脂酰肌醇3激酶(P13K)共同組成P13K/AKT信號通路。AKT1是P13K/AKT通路的重要組成部分，在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(PDK)1的輔助下，P13K通過使Akt蛋白上的磷酸化位點Thr308和Ser473磷酸化而使其激活，活化的AKT通過上調CyclinD1，磷酸化P21和P27等細胞周期蛋白，從而通過多種途徑促進細胞增殖，抑制細胞凋亡〔7，8〕。有研究發現〔9〕，抑制P13K/AKT通路可促進OA大鼠模型中軟骨細胞的凋亡和自噬。miRNA是一類長度約為22 nt的單鏈RNA，其通過抑制翻譯或降解靶基因在細胞生長、分化、增殖和凋亡等多種調控通路中發揮作用。近年來，已發現多種miRNA參與OA軟骨細胞的增殖和凋亡〔10～12〕。例如，miR-543在OA模型大鼠軟骨組織中呈低表達，過表達miR-543體外可促進軟骨細胞增殖〔10〕；miR-127-5p在OA軟骨細胞中表達下調，過表達miR-127-5p可促進軟骨細胞的增殖〔11〕。然而，miR-30a-5p在OA患者軟骨細胞中表達上調，且miR-30a-5p可通過靶向下調AKT，引起軟骨細胞周期阻滯，進而誘導OA患者軟骨細胞的凋亡〔12〕。miR-378作為一種癌基因或抑癌基因，其在宮頸癌〔13〕、肝癌〔14〕和前列腺癌〔15〕等多種惡性腫瘤中的作用已被廣泛報道。已有的研究〔6〕發現，miR-378c在骨關節軟骨組織中表達上調，但miR-378c對OA軟骨細胞的增殖和凋亡的影響及miR-378c能否介導AKT1表達調控OA軟骨細胞的增殖和凋亡尚不清楚。

本研究首先對正常軟骨組織和OA軟骨組織中miR-378c和p-AKT1的表達情況進行檢測，發現miR-378c在OA軟骨組織中明顯上調，p-AKT1表達顯著下調，提示miR-378c和p-AKT1在軟骨細胞中的正常表達對維持軟骨細胞的正常功能具有重要的意義。隨后通過構建抑制miR-378c表達HC-OA細胞株發現，HC-OA細胞活力顯著增強，凋亡率顯著降低，CyclinD1和Bcl-2蛋白表達顯著增加，P21和Bax蛋白表達顯著降低。CyclinD1通過與細胞周期蛋白激酶(CDKs)結合，形成CyclinD1/CDKs復合物，促使成視網膜細胞瘤蛋白(pRb)的形成，進而通過一系列核內過程促進細胞從G1期進入S期〔16〕。P21則抑制CyclinD1/CDKs復合物的形成發揮相反的作用〔17〕。當抗凋亡蛋白Bcl-2表達較高時，促凋亡蛋白Bax通過與Bcl-2結合形成異源二聚體Bax/Bcl-2抑制細胞凋亡〔18,19〕。抑制miR-378c表達可能通過抑制P21和Bax表達，促進CyclinD1和Bcl-2從而促進HC-OA細胞增殖，抑制細胞凋亡。雙熒光素酶報告基因檢測實驗顯示，AKT1是miR-378c的靶基因；Western印跡檢測顯示，miR-378c可負性調控AKT1的表達。為了進一步驗證miR-378c是通過下調AKT1來調控HC-OA細胞的增殖和凋亡，隨后把anti-miR-378c和si-AKT1共轉染HC-OA細胞后發現，干擾AKT1的表達可逆轉抑制miR-378c表達對HC-OA細胞增殖促進和凋亡抑制作用。提示，miR-378c可通過下調AKT1表達，抑制OA軟骨細胞的增殖，促進細胞凋亡。

綜上，miR-378c在人OA軟骨組織中高表達，AKT1呈低表達，且miR-378c可能通過靶向下調AKT1抑制OA軟骨細胞的增殖，促進細胞凋亡。這為研究OA的發病機制和臨床治療指明了新的發向。