豬鏈球菌2型的分離鑒定及致病性試驗

潘建剛，張華偉，陳波，周明光，王召賀，徐高原

(武漢科前生物股份有限公司，武漢 430070)

豬鏈球菌(Streptococcussuis)可引起豬腦膜炎、關節炎、心內膜炎、敗血癥、肺炎和突然死亡[1-2]，嚴重危害著養豬業的發展。根據莢膜多糖抗原的差異，可將其分為35個血清型，即1～34及1/2型[3]。對豬致病性較強的有豬鏈球菌1 型、2 型、7型和9型，尤其是豬鏈球菌2 型，不僅對豬的致病性最強，而且可感染特定人群并致死，是一種重要的人畜共患病病原菌[4]。本試驗從我國部分豬場分離出1株2型豬鏈球菌，鑒定菌株7種毒力因子基因，并用分離菌株進行了小鼠致病性試驗，以期為豬鏈球菌2型疫苗的研究提供必要條件和有利數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 2014-2016年從全國部分豬場采集疑似豬鏈球菌感染病例腦樣品，腦組織有明顯的肉眼可見出血，共20份。

1.1.2 豬鏈球菌培養基 TSA(Tryptic Soy Agar)、TSB(Tryptic Soy Broth)培養基購自BD生物科技有限公司。

1.1.3 主要試劑 新生牛血清購自內蒙古金源康生物工程有限公司；革蘭氏染液購自南京建成科技有限公司；引物合成及基因測序由擎科新業生物技術有限公司完成。

1.1.4 細菌基因組DNA提取試劑盒 購于北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.1.5 試驗動物 18～22 g的昆明鼠，購自湖北省實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離 將采集的20份腦樣品，分別于無菌操作臺中使用接種環挑取部分組織，均勻涂劃在加有5%新生牛血清的TSA平板中，于37 ℃條件下培養24 h，觀察結果。24 h后于無菌條件下挑取平板上的疑似菌落劃線接種于5%新生牛血清的TSA平板上，于37 ℃條件下培養24 h，觀察細菌形態。

1.2.2 PCR鑒定

1.2.2.1 DNA提取 用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，-20 ℃以下保存備用。

1.2.2.2 PCR引物 選取豬鏈球菌屬保守基因gdh(谷氨酸脫氫酶)，血清型特異性基因cas2J(莢膜多糖)以及7種主要毒力因子fbps(纖連蛋白原結合蛋白)、sly(溶血素)、orf2(毒力相關因子)、mrp(溶菌酶釋放蛋白)、89k(毒力島)、gapdh(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)和epf(胞外因子)基因，參考文獻設計引物[5-9]，引物序列見表1。

表1 豬鏈球菌引物Tab 1 Primer of Streptococcus suis

1.2.2.3 PCR檢測及測序分析 PCR擴增體系：10×buffer 5.0 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4.0 μL，引物P1(10 μmol/L)1.0 μL，引物P2(10 μmol/L)1.0 μL，模板DNA 2.0 μL，Taq酶(5 U/μL)0.25 μL，加注射用水至50 μL；反應條件為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環，72 ℃終延伸10 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳。用DNA回收試劑盒回收PCR產物，將該PCR產物連接pMD18-T載體，送擎科新業生物技術有限公司測序，并與BLAST上的相關序列比較分析。

1.2.3 形態觀察 按常規方法對分離菌株進行革蘭氏染色，普通光學顯微鏡下觀察菌體形態特征。

1.2.4 生長曲線的測定 分離菌株接種TSB液體培養基，37 ℃培養8～10 h作為種子液。再將上述種子液按培養基總體積的2%接種TSB培養基，于37 ℃搖床170 r/min振蕩培養。其間每隔2 h取樣進行活菌計數，監測24 h。

1.2.5 小鼠致病性試驗 采用半數致死量(LD50)評價分離菌的致病性，取30只雄性昆明小鼠，隨機分為6組，每組5只，其中5組作為攻毒組，一組作為對照組。濃縮菌液，調整菌液初始濃度為1.0×1010CFU/mL，進行10倍倍比稀釋，選取100～10-45個梯度，每個梯度攻毒一組小鼠，腹腔注射菌液0.2 mL，對照組腹腔注射0.2 mL生理鹽水。連續觀察14 d，記錄各組死亡情況，對死亡小鼠立即解剖，觀察病變情況，進行各臟器細菌分離、鑒定。根據Reed-Muench累加法計算分離菌株的LD50[10-11]。

2 結果與分析

2.1 細菌分離 20份腦組織分別接種TSA平板，通過挑選可疑菌落，對其純化，總共分出10株疑似菌株。在平板上可見灰白色、半透明、表面光滑、圓形、邊緣整齊的小菌落。

2.2 細菌鑒定 分離的10株細菌，用豬鏈球菌屬引物gdh進行PCR鑒定，其中3株能擴增出約695 bp大小的條帶，分別回收PCR產物進行測序，在NCBI上進行BLAST比對，顯示與豬鏈球菌對應的序列同源性在95%以上，說明分離菌株為豬鏈球菌(圖1)。

2.3 2型豬鏈球菌PCR鑒定 3株豬鏈球菌經過cas2J引物PCR鑒定，1株能擴增出長度約為387 bp大小的條帶，回收PCR產物進行測序，發現所測序列片段大小和預期片段大小相同，同時把測出的序列結果在NCBI上進行BLAST比對，顯示與對應血清型的序列同源性在95%以上，說明所擴增的基因即為目的基因(圖2)。

M:DL2000 DNA Marker;1-10:疑似菌株;11:陰性對照 M:DL2000 DNA Marker;1-10:suspicious strain；11:Negative control圖1 豬鏈球菌PCR鑒定結果Fig 1 PCR identification results for Streptococcus suis

M:DL2000 DNA Marker;1-3:豬鏈球菌;4:陰性對照 M:DL2000 DNA Marker;1-3:Streptococcus suis;4:Negative control圖2 2型豬鏈球菌PCR鑒定結果Fig 2 PCR identification results for Streptococcus suistype 2

2.4 毒力因子鑒定 分離的1株2型豬鏈球菌通過 PCR檢測了mrp、epf、sly、orf2、gapdh、fbps和89k 7種毒力因子，結果7種毒力因子在分離菌株中都能檢測到(圖3)。對上述菌株毒力基因測序分析，結果發現所測序列片段大小和預期片段大小相同，同時把測出的序列結果在NCBI上進行BLAST比對，顯示與對應的毒力因子序列同源性在95%以上，說明所擴增的基因即為目的基因，分離菌株基因中幾種主要毒力因子都有分布。

2.5 形態學特性 分離的2型豬鏈球菌經過革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察，細菌為革蘭氏陰性細小桿菌，具有多種不同形態，可見單個的球桿菌、桿菌或絲狀的菌體(圖4)。

2.6 生長曲線繪制 在液體TSB培養基中培養分離菌株，分離菌6 h左右開始進入對數生長期，培養8～10 h活菌數達到最高峰，但從10 h開始活菌數一直呈現下降趨勢。分離菌株在TSB液體培養基繁殖速度快，活菌數高(圖5)。

2.7 小鼠攻毒試驗 昆明小鼠腹腔注射不同濃度的菌液后，試驗小鼠最早于攻毒后第1天開始出現死亡現象，死亡高峰出現在攻毒后2～5 d，7 d后停止死亡。按Reed-Muench法計算，分離2型豬鏈球菌的LD50見表2。將濃縮菌液稀釋到4.8×107CFU/mL，攻毒0.2 mL，能使半數小鼠發生死亡，表明分離菌株毒力較強。

圖4 革蘭氏染色結果(100×)Fig 4 The results of Gram stain(100×)

圖5 2型豬鏈球菌生長曲線Fig 5 The growth curve of Streptococcus suis type 2

表2 半數致死量(LD50)試驗結果Tab 2 The results of LD50

2.8 剖檢觀察 剖檢攻毒死亡小鼠，可見攻毒小鼠腹腔內滲出液增多，腦和各臟器出血；試驗結束后剖檢空白對照組小鼠，可見健康對照組小鼠腹腔及各器官正常。結果見圖6。分離的2型豬鏈球菌能引起小鼠的急性敗血癥及腦膜炎，導致小鼠死亡，成功在小鼠上建立攻毒模型。

圖6 剖檢結果Fig 6 The results of anatomy

2.9 臟器細菌分離 剖檢死亡小鼠，取各臟器在無菌操作臺內進行細菌分離，結果顯示攻毒后死亡小鼠各臟器均能分離出細菌。對各臟器分離的細菌進行PCR鑒定并測序，結果表明各臟器分離菌株均為攻毒2型豬鏈球菌(圖7)。

圖7 攻毒小鼠各臟器細菌分離鑒定Fig 7 Isolation and identification of bacteria from various organs of challenged mice

3 討論與小結

豬鏈球菌是一種重要的人畜共患病病原，其致病性差異很大，只有高致病力菌株才能引起豬腦膜炎、關節炎、心內膜炎、敗血癥、肺炎和突然死亡等癥狀，低致病力和無致病力的菌株常見于豬的呼吸道。在致病性血清型中2 型的致病力最強，發病率最高，流行范圍最廣，其致病性和它的毒力因子相關[12-13]。現有疫苗菌株分離年代都比較久遠，保護效果有一定的降低。本研究采集最近幾年疑似豬鏈球菌感染病例腦樣品，經過平板分離和 PCR鑒定成功獲得一株2型豬鏈球菌，PCR檢測顯示分離菌株基因中幾種主要毒力因子都有分布，在TSB液體培養基繁殖速度快，活菌數高，能引起小鼠的急性敗血癥及腦膜炎導致小鼠死亡，證明分離株毒力強，是潛在的疫苗菌株。