超聲波-微波協同輔助萃取紫蘇葉黃酮工藝優化及其抗氧化活性研究

（齊齊哈爾工程學院，黑龍江齊齊哈爾161005）

紫蘇是一年生直立草本植物，在中國常用于中藥，具有極強的經濟價值。目前，針對紫蘇資源的開發多集中在紫蘇油上。大多數植物油是非常好的亞油酸來源，但只有很少的植物油在飲食中含有大量的α-亞麻酸（α-linolenic acid，α-LNA）。其中，紫蘇籽油中n-3脂肪酸含量最高，約占57%[1-2]。一些研究表明，α-LNA及其高級衍生物在生理學上具有某些獨特和必需的功能[3]，n-3脂肪酸攝入的增加會具有降低血脂的功能[4-5]。據報道，紫蘇油可改善學習能力、視網膜功能、抗氧化、抑制癌變和轉移等[6]。紫蘇葉也具有極高的經濟利用價值，是一種良好的保健食物來源之一。其具有抗氧化、增強機體對外界致敏原的抵抗能力、抑菌、抗腫瘤等生物活性，主要是其含豐富的酚類化合物，如精油、迷迭香酸、花青素、咖啡酸、維生素和礦物質[7-13]。因此，針對于紫蘇葉中黃酮的提取，對其資源的開發以及高值化應用具有重要的經濟效益和實際意義[14]。

但目前關于紫蘇葉的研究多集中于提取及純化上，且提取工藝主要包括溶劑提取法[15-16]、超聲輔助提取法和微波輔助提取等工藝[17-18]。但是關于利用超聲微波協同輔助萃取紫蘇葉黃酮的工藝鮮有報道。超聲-微波協同輔助萃取是超聲輔助法和微波輔助法發展起來的一項新技術，是超聲與微波的有機結合，充分利用了微波的高能穿透效應和超聲空化碰撞效應，克服了常規提取、超聲輔助提取和微波輔助提取的缺點，并且提取速度快，效率高[19-20]。此外，研究表明黃酮具有抗氧化、抗衰老、抗炎、鎮痛和抗腫瘤等生物活性，在保健品、醫藥和食品等領域均具有廣闊的實用價值[21-23]。但是關于紫蘇葉黃酮的體內抗氧化活性還尚未見報道。

因此，本文以紫蘇葉為原料，利用超聲-微波協同輔助萃取紫蘇葉黃酮，以紫蘇葉黃酮提取量為指標，確定其最佳提取工藝參數，并通過H2O2誘導RAW264.7巨噬細胞構建氧化應激模型，測定紫蘇葉黃酮對巨噬細胞增殖率及胞內抗氧化物酶系的影響，進一步探討其體內抗氧化活性研究，為紫蘇葉黃酮的工業化生產和紫蘇葉生物活性物質的深度開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇葉：吳氏生態農業有限公司；蘆丁對照品：上海源葉有限公司；RAW264.7巨噬細胞：武漢大學生命科學學院；DMEM高糖培養基：索萊寶生物有限公司；低內毒素胎牛血清、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、胰酶消化液、CCK-8 試劑盒：碧云天生物制劑研究所；抗氧化物酶試劑盒：上海酶聯有限公司；乙醇、過氧化氫、氫氧化鈉、硝酸鋁、抗壞血酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

CW-2000超聲-微波協同輔助萃取儀（超聲功率固定300 W）：上海新拓微波溶樣測試技術有限公司；Pulverisette 14多功能粉碎機：德國飛馳有限公司；BBS-SDC超凈工作臺：山東博科生物產業有限公司；MSE124S-OCE-DU電子分析天平：賽多利斯（上海）貿易有限公司；HF-90 CO2培養箱：上海力康醫療設備有限公司；UV-2600型紫外-可見分光光度計：日本島津公司；ELX-800酶標儀：賽默飛有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃酮提取工藝及提取量的測定

將紫蘇葉在60℃的條件下烘干4 h，多功能粉碎機粉碎后過40目篩，準確稱取20.0 g紫蘇葉粉置于燒杯內，在不同的料液比、乙醇濃度的條件下，置于超聲-微波協同輔助萃取儀進行萃取，于不同的提取時間和微波功率下提取紫蘇葉黃酮，提取液8 000 r/min離心10 min，采用以蘆丁為標準的比色法測定黃酮含量[24]，于510 nm波長處測量吸光度，并計算紫花葉黃酮的提取量。

式中：C為提取液中黃酮含量，mg/mL；V為提取液體積，mL；M為紫蘇葉質量，g。

1.4 超聲波-微波協同輔助萃取黃酮工藝條件的選擇

1.4.1 單因素試驗設計

設置4個因素的不同水平，即料液比1∶5、1∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL），乙醇體積分數 60%，提取時間10 min，微波功率100 W；乙醇體積分數為50%、60%、70%、80%、90%，料液比 1∶10（g/mL），提取時間10 min，微波功率100 W；提取時間5、10、15、20、25 min，液料比 1 ∶10（g/mL），乙醇體積分數 60%，微波功率 100 W；微波功率 0、100、300、500、700 W，液料比 1∶10（g/mL），乙醇體積分數 60%，提取時間 10 min；研究不同提取條件對紫蘇葉黃酮提取效果的影響。

1.4.2 響應面優化超聲波-微波協同輔助萃取紫蘇葉黃酮工藝

根據單因素試驗試驗結進行Box-Behnken試驗設計，以黃酮提取量為指標，確定最優黃酮提取條件，試驗因素水平編碼見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素水平編碼表Table 1 Factors and code levels

1.5 紫蘇葉黃酮抗氧化活性的檢測

參照何力[25]的方法進行紫蘇葉黃酮的純化（純化后的紫蘇葉黃酮純度為84.68%），在此基礎上進行抗氧化活性試驗。

1.5.1 細胞的培養和分組

試驗分為正常對照組、模型對照組和紫蘇葉黃酮試驗組。其中正常對照組：不加紫蘇葉黃酮和H2O2干預處理，只加入等體積的無胎牛血清的培養基溶液；模型對照組：不加紫蘇葉黃酮干預，加入等量的無胎牛血清的培養基溶液培養24 h后，加入終濃度為2 mmol/L H2O2溶液刺激1 h；紫蘇葉黃酮試驗組：紫蘇葉黃酮（總濃度分別為 50、100、200、400 μg/mL）干預24h后，加入終濃度為2 mmol/L H2O2溶液刺激1h。具體細胞培養的方法參照郭增旺等[26]的方法進行。

1.5.2 紫蘇葉黃酮對H2O2誘導RAW264.7氧化損傷細胞存活率的影響

參照馬萍等[27]的方法，并略加改動。按CCK-8法試劑盒說明書進行試驗，并測定存活率。其計算公式如下所示。

1.5.3 紫蘇葉黃酮對H2O2誘導HepG2氧化損傷細胞的胞內抗氧化酶系的影響

參照馬萍等[27]的方法，并略加改動。按照1.5.1分組方法處理細胞后，采用預冷的PBS緩沖液進行洗滌3遍后刮取細胞，并加入100 μL細胞裂解液，收集裂解液后4℃、12000×g離心10min。取上清液按照試劑盒說明書操作檢測過氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）及過氧化氫酶（catalase，CAT）的酶活力。

1.6 數據處理

本試驗均重復3次測定值的平均值±標準偏差，采用SPSS 20.0軟件的對數據進行差異顯著性分析（One Way ANOVA），P＜0.05表明具有差異顯著性，采用Design Expert 8.0軟件分析響應面試驗結果。

2 結果與分析

2.1 標準曲線繪制

配制蘆丁標準溶液，繪制黃酮濃度與吸光度值的標準線性回歸方程：A=8.110 7C+0.005 6，其中R2=0.996 2，則紫蘇葉黃酮提取量的計算公式如下所示。

式中：M為紫蘇葉的質量，g；A為紫蘇葉黃酮提取液的吸光度值。

2.2 單因素試驗分析

2.2.1 料液比對紫蘇葉黃酮提取量的影響

料液比對紫蘇葉黃酮提取量的影響見圖1。

圖1 料液比對紫蘇葉黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of liquid ratio on the extraction of flavonoids from perilla leaf

由圖1可知，隨著溶劑體積的增加，紫蘇葉黃酮提取率呈現先升高后下降的趨勢，且當料液比為1∶15（g/mL）時，紫蘇葉黃酮的提取率達到最高。當溶劑體積較少時，浸提體系的溶質和溶劑更易達到相互擴散的動態平衡，導致紫蘇葉黃酮的提取量較低；隨著溶劑體積的升高，紫蘇葉里的黃酮成分更易擴散到溶液中，導致黃酮的提取量提高；但當溶劑體積過高時，射流空化所作用的能量更多的輻射在溶劑上，導致紫蘇葉中的溶質分子所吸收的能量有所下降，還伴隨著溶出了其他脂溶性雜質[28]，這不但會降低黃酮的提取量而且造成后續濃縮的工業成本升高，故選擇料液比為1 ∶15（g/mL）。

2.2.2 乙醇濃度對紫蘇葉黃酮提取量的影響

乙醇濃度對紫蘇葉黃酮提取量的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對紫蘇葉黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction of flavonoids from perilla leaf

由圖2可知，隨乙醇濃度的增加，紫蘇葉黃酮的提取率呈先增大后減小的趨勢，且在乙醇濃度為60%時，提取量達到最大值。隨著乙醇濃度的升高會引起紫蘇葉細胞的溶脹系數的改變進而促進了乙醇及水分子在細胞內外的流動，從而使提取量增加[29]；而當乙醇濃度超過60%后，材料細胞的溶脹系數不在變化，此時溶劑極性的下降可能成為了影響提取量的主要因素，導致醇溶性雜質、色素及脂溶性雜質與黃酮分子相互競爭的結合溶劑分子，引起黃酮類化合物的溶解度和結合率的降低[30]，導致黃酮提取量下降。因此，選擇乙醇濃度為60%。

2.2.3 提取時間對紫蘇葉黃酮提取量的影響

提取時間對紫蘇葉黃酮提取量的影響見圖3。

圖3 提取時間對紫蘇葉黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of jet cavitation time on the extraction of flavonoids from perilla leaf

由圖3可知，隨著提取時間的增加，黃酮提取量先增加后減小，且提取時間為20 min時黃酮提取量達到最大。在超聲與微波的協同作用會增強分子的振蕩和碰撞[31]，紫蘇葉黃酮會快速進入乙醇溶液，有助于增加黃酮提取量；但提取時間過長會破壞黃酮的結構，同時黃酮類化合物會隨著溶劑的不斷蒸發而損失或降解[32]，從而引起黃酮提取量降低。因此，選擇提取時間為20min。

2.2.4 微波功率對紫蘇葉黃酮提取量的影響

微波功率對紫蘇葉黃酮提取量的影響見圖4。

圖4 微波功率對紫蘇葉黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of microwave power on the extraction of flavonoids from perilla leaf

由圖4可知，紫蘇葉黃酮提取量隨著微波功率的升高呈先升高后下降的趨勢，且在微波功率為300W時提取量達到最高。這可能是由于微波能促進植物細胞壁的破裂和分子的布朗運動，進而促進了紫蘇葉黃酮分子的溶出，導致紫花葉黃酮的提取率隨著微波功率的升高而逐漸升高[33]。但是過高的微波功率會導致紫蘇葉黃酮發生一定的氧化反應和降低，且會促進其他醇溶性雜質的溶出，進而導致其提取率的下降[34]。因此，選擇最佳的微波功率為300 W。

2.3 響應面試驗結果分析

2.3.1 試驗模型的建立及其顯著性檢驗

根據單因素試驗結果，采用Design Expert 8.0軟件對試驗數據進行多元回歸擬合，分析各因素對紫蘇葉黃酮提取量（Y）的影響，試驗方案及結果見表2。

表2 試驗方案及結果Table 2 Experiment structural matrix and results

用Design Expert 8.0軟件對表2的結果進行多元回歸分析，得到紫蘇葉黃酮提取量（Y）與料液比（X1）、乙醇濃度（X2）、提取時間（X3）、微波功率（X4）的編碼的二次多項式回歸方程如下：

Y=8.10+0.62X1+0.14X2+0.39X3+0.40X4-0.16X1X2+0.035X1X3-0.49X1X4+0.60X2X3+0.12X2X4+0.04X3X4-0.46X12-0.79X22-1.03X32-0.82X22

其中模型決定系數R2=0.958 6校正的R2=0.917 2。

回歸模型方差分析見表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance（ANOVA）for the quadratic model

從表3中可以得出模型的F值為23.15，對應的P值小于0.000 1，表明達到極顯著水平，且失擬項P為0.102 8大于0.05，表明差異不顯著，這說明該模型對紫蘇葉黃酮的提取量具有較好的擬合度，可用于模型分析。由F值可知，各因素的主次順序為：料液比＞微波功率＞提取時間＞乙醇濃度?；貧w方程系數顯著性檢驗結果：X1、X3、X4的一次項及二次項均達到極顯著水平（P<0.01），X2的一次項差異不顯著（P＞0.05）、二次項達到極顯著性水平（P＜0.01）；交互項 X1X4，X2X3達到極顯著（P＜0.01），其他交互項均不顯著。

2.3.2 因素交互效應分析

響應面相互作用見圖5。

圖5 交互效應圖Fig.5 Interaction effect diagram

由圖5可知，紫蘇葉黃酮提取量隨著各因素的編碼水平增高呈現先升高后下降的趨勢。通過比較各因素等高線的密集程度發現，乙醇濃度等高線的密集程度顯著低于料液比、提取時間和微波功率的等高線，這表明乙醇濃度對紫蘇葉黃酮提取量的影響因子顯著低于料液比、提取時間和微波功率；通過比較因素交互作用中心和底部等高線的中心點位置發現，圖5a和5b的兩者位置均發生了明顯偏移，這表明料液比-微波功率間的交互作用和乙醇濃度-提取時間的交互作用均較為顯著，這些結果均和方差分析結果一致。因此，交互作用表明只有4個試驗因素進行合理組合的情況下，才能獲得最優的紫蘇葉黃酮的提取工藝。

2.3.3 最優工藝驗證

根據優化試驗得到紫蘇葉黃酮的最佳提取工藝參數為：料液比為 1 ∶17（g/mL），乙醇濃度為 62%，時間為20 min，微波功率為300 W，在此條件下預測得到黃酮提取量為8.28 mg/g。根據此條件進行驗證試驗后獲得的實際提取量為8.33 mg/g，誤差小于1.0%，說明優化后的工藝條件可靠，方程擬合良好，具有參考價值。

2.4 紫蘇葉總抗氧化活性分析

2.4.1 紫蘇葉黃酮對H2O2刺激RAW264.7細胞增殖的影響

紫蘇葉黃酮對H2O2刺激RAW264.7細胞增殖的影響見表4。

表4 紫蘇葉黃酮對H2O2刺激RAW264.7細胞增殖的影響Table 4 Effects of perilla leaf flavonoids on the proliferation of RAW264.7 cells stimulated by H2O2

細胞的增殖率是反映外界環境對細胞損傷的最直觀指標。氧化應激環境可以導致胞內活性氧升高和氧化應激酶系失活，進而導致細胞發生氧化損傷和引起細胞凋亡[35]。H2O2是一種常見的氧化應激源，在氧化應激試驗中常作為模型藥物進行構建體外氧化應激損傷模型，其分子中的O22-能和胞內鐵離子和膜上脂質物質及蛋白質發生氧化應激反應，造成細胞氧化損傷[36]。由表4可知，與正常組相比，氧化應激模型組的細胞存活率顯著下降（P<0.05），這表示H2O2構建的RAW264.7氧化應激模型成功，可用于后續試驗；與氧化應激模型組相比，紫蘇葉黃酮在劑量高于100 μg/mL可顯著提高細胞的存活率（P<0.05），且呈現劑量依賴性關系。這表明紫蘇葉黃酮在一定程度上對RAW264.7具有保護作用，能顯著緩解H2O2對RAW264.7的氧化應激損傷，從而提高細胞的存活率，具有一定的抗氧化效果。

2.4.2 紫蘇葉黃酮對H2O2刺激RAW264.7胞內抗氧化酶系的影響

紫蘇葉黃酮對H2O2刺激RAW264.7胞內抗氧化酶系的影響見表5。

表5 紫蘇葉黃酮對H2O2刺激RAW264.7胞內抗氧化酶系的影響Table 5 Effects of perilla leaf flavonoids on intracellular antioxidant enzymes stimulated by H2O2in RAW264.7

機體存在自身的氧化應激調節體系如酶抗氧化系統進行防御外界氧化應激源對機體造成傷害[37]。谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、總超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）是抗氧化物酶系的重要組成部分，其抗氧化物酶系酶活力的水平直接反映出機體對外界氧化應激源的平衡調控能力[38]。由表5可知，與正常組相比，氧化應激模型組的胞內酶活力顯著下降（P<0.05），這表示H2O2降低RAW264.7細胞胞內的抗氧化酶活力，導致細胞氧化動態平衡遭到嚴重的破壞；與模型組相比，當紫蘇葉黃酮在劑量高于100 μg/mL可顯著提高胞內SOD、CAT、GSH-Px的酶活性（P<0.05）。這表明紫蘇葉黃酮預培養后可顯著緩解H2O2所引起的胞內抗氧化物酶系酶活力的降低和提高機體對外界氧化應激的調控能力。這和之前紫蘇葉黃酮能緩解H2O2所引起細胞存活率降低的結果相一致。以上結果表明，紫蘇葉黃酮的抗氧化作用可能與調節機體的抗氧化物酶系酶活力，恢復機體的氧化應激調節系統有關，但是其具體抗氧化機理還需要進一步的研究。

3 結論

研究結果表明，影響紫蘇葉黃酮提取量因素大小順序為料液比＞微波功率＞提取時間＞乙醇濃度，最佳提取工藝參數為料液比是1∶17（g/mL）、乙醇濃度是62%、時間是20 min、微波功率是300 W，此工藝條件紫蘇葉黃酮的提取量為8.33 mg/g；抗氧化試驗顯示，紫蘇葉黃酮能顯著提高氧化應激環境下RAW264.7細胞的存活率，恢復胞內抗氧化物酶系酶活力。這表明紫蘇葉黃酮能通過提高胞內抗氧化酶系的活性進行緩解氧化應激損傷，是一種新型的天然抗氧化物。