葉黃素對大鼠視網膜LED藍光損傷的保護作用

楊嬌 張雅琴 張黎 廖章伊 侯艷梅 詹智鈞 謝奎 張召鋒

摘 要：目的：探討葉黃素對視網膜LED藍光損傷的保護作用。方法：48只雄性SD大鼠（6～8周齡，體重180～220g）隨機分為6組：正常對照組、模型對照組、溶劑對照組，葉黃素低、中、高劑量組（25、50、100mg/kg）。以純玉米油為溶劑，將葉黃素溶于玉米油中灌胃飼養30d。飼養末，將所有實驗動物置于暗室中暗適應24h后，除正常對照組外，其余大鼠用LED藍光損傷裝置制備大鼠視網膜LED藍光損傷動物模型，光暴露時間為1.5h，光暴露強度為1 400～1 500lux，光暴露后暗室飼養。24h后股靜脈采血、處死，摘取眼球制備眼球壁石蠟切片，HE染色后觀察視網膜形態學變化，測定血清中氧化應激相關指標。結果：模型對照組和溶劑對照組大鼠視網膜外核層厚度較正常對照組顯著降低;經過葉黃素預處理的大鼠，在LED藍光損傷后，視網膜外核層厚度降低不明顯。大鼠接受LED藍光損傷后，與正常對照組相比，模型對照組血清中丙二醛（MDA）的含量顯著增加（P<0.05），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的含量顯著降低（P<0.05）。與模型對照組和溶劑對照組相比，葉黃素各劑量組血清中MDA含量減少（P<0.05），而GSH-Px含量顯著增加（P<0.05），但葉黃素三個劑量組之間MDA和GSH-Px無顯著差異（P>0.05）。結論：葉黃素對大鼠視網膜LED光損傷有明顯的保護作用，可能的機制是通過淬滅氧自由基，抑制脂質過氧化發揮其保護作用的。

關鍵詞：LED藍光;視網膜;葉黃素

發光二極管（LED）是一種長壽命的低發熱光源，其需要很少的電力，因而使得LED在智能電話、計算機等電子設備的液晶顯示器上得到了廣泛使用。然而，電流LED發出的藍光強度遠高于白熾燈、熒光燈和自然光發出的藍光[1]。科技的發展和電子產品的普及使得人們花費更多的時間在電子產品上。過度使用電子產品的人不僅易患上電腦視覺綜合癥，如眼睛疲勞的增加[2]，也會導致藍光（400～500 nm）暴露增加，而這是導致一些眼部疾病的危險因素，如年齡相關性視網膜黃斑變性（AMD）[3]。葉黃素為一種含氧的類胡蘿卜色素，是視網膜黃斑色素的主要組成成分，主要存在于視網膜周圍區域[4]。葉黃素由于具有過濾藍光[5]、抗氧化[6-7]、抗炎[8]等作用在預防一些視網膜疾病如AMD[9]、糖尿病視網膜病變[10]、葡萄膜炎[11]和光誘導視網膜變性[12]等疾病中受到了廣泛關注。但目前關于葉黃素防護LED藍光損傷的研究還較少報道。我們推測，由于葉黃素具有以上多種生物學作用，可能在LED誘導的視網膜藍光損傷中也具有良好的防護作用。因此，本研究以葉黃素為補充物質，研究葉黃素對大鼠視網膜LED藍光損傷的保護作用及可能機制，為葉黃素用于防治眼部疾病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠48只，6周齡，體重180～200g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗大鼠飼養在中國疾病預防控制中心動物實驗中心屏障環境。溫度范圍為（22±2）℃，相對濕度為50%～60%，晝：夜明暗交替時間為12 h∶12 h。

1.2 主要試劑與儀器

葉黃素，淡黃色固體粉末，純度為98%，分子量為568.88，陜西森弗天然制品有限公司;純玉米油，淡黃色油性液體，上海阿拉丁生化科技股份有限公司;超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測定試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒、一氧化氮（NO）測定試劑盒，南京建成生物工程有限公司;低溫高速離心機，德國Eppendorf公司;光損傷儀（自制）、暗適應箱（自制）、手術顯微鏡（OPMI6-CFC，SONY，日本）、光學顯微鏡（ECLIPSS E400，Nikon，日本）、石蠟切片機（LEICA RM 2135，德國）、遠方SPIC-200A光譜彩色照度計，杭州遠方儀器有限公司;微量注射器、止血鉗、持針器、角膜剪。

1.3 動物分組與處理

動物適應性飼養1周后，隨機分為6組（n=8）：正常對照組、模型對照組、溶劑對照組，低、中、高劑量葉黃素組（25、50、100mg/kg）。葉黃素各劑量組灌胃給予相應濃度葉黃素，溶劑對照組以等體積玉米油灌胃，連續30d。灌胃結束后，將大鼠放入暗室中進行暗適應24h，除空白對照組外，其余各組放入光損傷裝置中進行光暴露。光損傷工作參數為：LED藍光燈帶波長為452nm、光強為1 400～1 500lux、光暴露時間為1.5h，光暴露結束后將大鼠放回暗室中繼續飼養，24h后處死、取眼球。

1.4 指標測定與方法

1.4.1 視網膜形態學觀察 摘除眼球，放入4%多聚甲醛中進行固定。對固定后的眼球壁脫水，脫水后透明，接著將透明的大鼠眼球壁放入蠟缸中浸蠟，包埋蠟塊，用石蠟切片機進行切片，每張片子厚度約為5μm，然后進行蘇木素-伊紅（HE）染色，40×10倍光學顯微鏡下觀察視網膜結構和細胞形態變化。

1.4.2 大鼠血清氧化應激指標檢測 按照試劑盒說明書進行大鼠血清SOD、GSH-Px水平及MDA、NO含量測定。

1.5 統計分析

用SPSS 25.0軟件對數據進行統計分析。連續變量用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，采用最小顯著差異t檢驗法進行組間的兩兩比較，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 視網膜結構與視網膜外核層變化

HE染色觀察，正常對照組大鼠視網膜結構層次分明，視網膜內外節排列整齊，外核層（ONL）細胞核層次清楚，排列緊密（附圖）。模型對照組和溶劑對照組大鼠視網膜ONL厚度顯著降低（表1），且細胞核出現濃染（附圖B、C）。葉黃素低劑量組和中劑量組大鼠與模型對照組比較，視網膜ONL厚度顯著增加（表1），ONL細胞中未出現濃染（附圖D、E）。而葉黃素高劑量組ONL厚度與模型對照組相比無明顯差異（表1），ONL細胞核出現少許濃染（附圖F）。

2.2 抗氧化指標檢測結果

與正常對照組相比，大鼠接受LED藍光損傷后，血清中脂質過氧化產物MDA的含量顯著增加，GSH-Px含量顯著降低（P<0.05）。與模型對照組和溶劑對照組相比，3個劑量葉黃素組血清中MDA含量顯著減少（P<0.05），而GSH-Px含量顯著增加（P<0.05），但葉黃素不同劑量組之間MDA和GSH-Px無顯著差異（P>0.05）;SOD、NO水平在各組間差異無顯著性（表2）。

3 討論

藍光暴露是目前研究視網膜光損傷常見的造模方式，但既往有關視網膜光損傷的研究中，光源類型、強度、時間等很多均不一致，尚無公認的造模方式。成年大鼠和小鼠均可進行視網膜光損傷的研究。SD大鼠普遍用于營養實驗，比Wistar大鼠的適應性和抗病能力更強。考慮到目前電子產品的廣泛使用，采用LED藍光暴露制備SD大鼠視網膜損傷模型[13]。預實驗觀察發現，LED藍光強度為1 400～1 500lux、光照強度為1.5h時，大鼠視網膜電圖出現明顯變化，變化趨勢穩定。因此本研究控制光照強度在1 400～1 500lux之間，結果顯示，葉黃素每日25、50mg/（kg·d）灌胃預處理的大鼠，在LED藍光照射后，視網膜ONL厚度未出現顯著降低。未經葉黃素預處理的模型對照組與對照組相比，視網膜ONL厚度降低，且細胞核出現濃染。考慮到本研究所采用的溶劑為玉米油，為排除溶劑所帶來的影響，加設了溶劑對照組。結果顯示，溶劑對照組與模型對照組相比，大鼠視網膜形態學和ONL厚度均無顯著差異，說明溶劑對大鼠視網膜光損傷無保護作用，進而證明葉黃素對大鼠視網膜光損傷保護作用的確切性。

本研究結果顯示，葉黃素各劑量組大鼠血清中的MDA含量均低于模型對照組和溶劑對照組中的含量，這提示葉黃素可能是通過抑制大鼠視網膜的脂質過氧化反應來發揮其保護作用。MDA被廣泛認為是光誘導的視網膜損傷中氧化應激的標志物。在人視網膜色素上皮細胞中，MDA由光反應性脂褐素顆粒產生，脂褐素顆粒產生H2O2和其他潛在的細胞毒性分子以作為對過度光照射的反應[14]。當前研究結果與徐賢榮等[15]的研究結果一致，其研究發現，大鼠玻璃體注射葉黃素能夠通過降低視網膜中MDA含量而一定程度上預防藍光暴露所誘導的視網膜損傷。此外，有研究表明，葉黃素對光損傷的保護作用還可能與調節細胞信號轉導有關[16]。神經元型一氧化氮合酶（nNOS）在大鼠光損傷視網膜中表達增加[17]。現有研究顯示，視網膜中nNOS介導NO的產生，其在高濃度時對視網膜細胞具有毒性作用[18]。在本研究中，大鼠視網膜光損傷后，血清中NO濃度有所增加，但是此種增加無統計學差異，葉黃素對各實驗組血清中NO濃度無顯著影響。同樣徐賢榮等[15]在其研究中也報道，大鼠光損傷視網膜中nNOS的含量總量減少，但是差異無顯著性;葉黃素對大鼠光損傷視網膜中nNOS無明顯影響。

SOD和GSH-Px是體內重要的抗氧化酶類，與在其他組織一樣，在視網膜中，SOD將超氧陰離子轉化為過氧化氫，而GSH-Px則通過谷胱甘肽催化其還原形成水[19-20]。本研究結果顯示，光損傷大鼠血清中SOD活性降低，這與之前研究一致[21-23]。Kamoshita等[24]發現，在光暴露24h時葉黃素可以抑制光損傷小鼠視網膜色素上皮細胞活性氧物質增加，并增強SOD活性;在48h時持續性的增加SOD1、SOD2 mRNA水平。然而在當前的研究中，血清中的SOD 濃度在各組間并無顯著的差異，分析其原因可能是在當前的研究中測定的是血清中SOD活性，而非視網膜中SOD活性，可能只有在視網膜SOD活性達到一定程度的變化后，血清中才會出現相應變化。現有研究顯示，在光誘導的氧化應激下，大鼠視網膜中GSH-Px活性降低或不變[21，25]。在當前研究中顯示大鼠視網膜光損傷后血清中GSH-Px活性顯著降低，其結果進一步說明，機體沒有足夠活性的氧化酶清除光損傷所產生的過多活性氧是光損傷的機制之一。本研究結果還表明，持續性的補充葉黃素顯著增強了視網膜光損傷大鼠血清中的GSH-Px活性，有效防止了過度光暴露所導致的視網膜損傷。然而已有的體外研究報道，光暴露導致人視網膜色素上皮細胞中GSH-Px活性增加，而葉黃素則抑制了這種增加[20]，分析其結果不一致的原因可能是：（1）已有報道的體外研究中所用到的暴露光源是太陽紫外線B，而當前研究中暴露光源是LED藍光，光源的差異可能是其造成結果不一致的原因之一;（2）機體是一個復雜多變的系統，體外實驗可能并不能模擬體內真實的復雜多變的情況，因此，酶抗氧化防御系統在視網膜光損傷中的作用機制以及葉黃素對該系統的影響還需要進一步的研究加以明確。

綜上所述，葉黃素可通過抑制大鼠血清MDA水平升高，增加GSH-Px水平來發揮對視網膜LED藍光損傷的保護作用。

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Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of lutein on retinal damage induced by blue light emitting diodes （LEDs）in rats.MethodForty-eight male Sprague-Dawly （SD）rats （6 weeks old，180 to 220g）were randomly assigned to 6 groups，including a normal，a model，a solvent and three lutein groups （25，50，100mg/kg）. Corn oil was used as solvent to dissolve lutein. Before the light exposure，the rats were dark-adapted by keeping them in complete darkness for 24h after lutein supplementing for 30 days. Then，apart from the normal group all the pupils were exposed to 1 400～1 500 lux of blue LEDs for 1.5 h. After that the rats were killed，the eyes were removed and were processed to paraffin section for microscopy，then we observed the changes of retina morphous. The content of serum glutathione peroxidase （GSH-Px），superoxide dismutase （SOD），malondialdehyde （MDA），and nitric oxide （NO）were measured using oxidative stress kit. ResultThe thickness of outer nuclear layer （ONL）in model control group and solvent control group decreased significantly compared with the normal group. Compared with the model control group，the thickness of the ONL was increased in low and middle lutein groups. The content of serum MDA increased in the rats induced by photic injury and the increase was inhibited significantly in lutein groups （P<0.05），but no dose-dependent respondence. Compared with those of the normal group，the serum GSH-Px level of the model and solvent groups was reduced （P<0.05），while the GSH-Px was significantly increased in all lutein groups （P<0.05）. The levels of NO and SOD were not significantly changed in all groups （P<0.05 and P<0.05，respectively）.ConclusionIn the present study，the effect of prevention of lutein on retina blue LED-light damaged was significant. The mechanisms of lutein protecting retina from blue LED-light damage might be associated with quenching singlet oxygen，inhibiting lipid peroxidation.

Keywords：blue LED-light;retina;lutein

（責任編輯 李婷婷）