白消安對U87 膠質瘤干細胞增殖和自我更新的影響

趙艦，張良龍，金亮，張維，蘭偉途

作者單位：滄州市人民醫院神經外科，河北 滄州061000

研究發現，將神經干細胞的實驗理論方法應用于腫瘤干細胞，發現膠質瘤病人的瘤灶中存在腫瘤干細胞，其在膠質瘤發生發展中起著重要作用［1］。目前臨床中對于膠質瘤的治療原則主要為抑制腫瘤細胞的侵襲、增殖，進而達到抑制腫瘤擴散的目的［2］。白消安為臨床中緩解性治療慢性粒細胞白血病的常用藥物之一，或者與其他藥物聯合使用，清除體內造血干細胞，為慢性髓性白血病病人進行干細胞移植奠定基礎［3］。白消安應用于膠質瘤干細胞的研究較少，因此，本研究于2018年1月至2019年1月，探究白消安對U87 膠質瘤干細胞增殖和自我更新的影響。具體報道如下。

1 材料與方法

1.1主要材料U87 膠質瘤干細胞由中國科學院上海細胞生物學研究所提供；白消安由Sigma 公司提供，與二甲基亞砜相溶（濃度為100μmol/L），保存于-20 ℃條件中，用時再用DMEM/F12 稀釋至所需濃度；DMEM/F12 培養基（由Hyclone 公司提供）；胎牛血清（由Gibco 公司提供）；胰蛋白酶（由Gibco 公司提供）；二甲基亞砜（由Thermo 公司提供）；B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）抗體（由北京中杉金橋生物技術公司提供）。

1.2 U87膠質瘤干細胞培養將U87 膠質瘤干細胞接種于含有10%胎牛血清的DMEM/F12 培養集中，放置于37 ℃、5%二氧化碳的細胞培養箱中，2～3 d換1次液，當細胞密度達80%～90%時進行傳代。

1.3 U87膠質瘤干細胞增殖情況觀察采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT法）檢測U87膠質瘤干細胞增殖情況；取對數生長期U87 膠質瘤干細胞，接種于平底96孔板中，細胞數為1×104/孔，培養24 h 后，分為A、B、C、D 組，A 組僅加入200 μL 含5%胎牛血清的DMEM/F12培養基，B、C、D三組分別加入200 μL 含20、50、100 μmol/L 白消安的DMEM/F12 培養基，四組作用24 h、48 h、72 h 后棄上清，采用MTT 還原法，用酶標儀在490 nm 波長檢測吸光度，以其中不含細胞的空白孔進行調零。

1.4 U87膠質瘤干細胞凋亡情況觀察（1）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）：取對數生長期U87 膠質瘤干細胞，接種于有無菌玻片的24孔板中，細胞數為5×105/孔，培養24 h 后，分為A、B、C、D 組，A 組僅加入200 μL 含5%胎牛血清的DMEM/F12 培養基，B、C、D 三組分別加入 200 μL 含 20、50、100 μmol/L 白消安的DMEM/F12 培養基，培養72 h；取上清，將上清與包被液按照1∶1 混勻，加入96 孔酶標板中，放置于4 ℃條件下過夜；之后在37 ℃條件下封閉1.5 h，分別加入Bcl-2、Bax、Caspase-3抗體（均按照1∶1 000稀釋），放置于4 ℃條件下過夜；之后加入二抗（按照1∶1 000 稀釋），在室溫下孵育1.5 h，二氨基聯苯胺法（DAB）避光顯色，當顏色發生改變時，停止顯色，在酶標儀490 nm波長處檢測吸光度值。

（2）免疫組化法：細胞培養、分組、干預方法與ELISA法相同；U87膠質瘤干細胞培養72 h后，吸出上清，用10%甲醛固定細胞30 min，室溫下干燥；用內源性過氧化物酶滅活；四組分別加入Bcl-2、Bax、Caspase-3抗體（均按照1∶1 000稀釋），放置于4 ℃條件下過夜，之后滴加試劑1，放置于37 ℃條件下20 min，滴加試劑2，放置于37 ℃條件下30 min，DAB避光顯色，之后用蘇木素復染，常規脫水、透明、封片。將片子放置于顯微鏡下觀察，Bcl-2、Bax、Caspase-3陽性細胞為胞質中黃色或棕褐色顆粒呈彌漫性分布；記錄Bcl-2、Bax、Caspase-3 陽性表達細胞數，陽性細胞表達率＝（陽性細胞數/總細胞數）×100%。

1.5 U87膠質瘤干細胞細胞周期觀察取對數生長期U87 膠質瘤干細胞，按1×106接種于培養瓶中（T25），培養24 h 后，分為A、D 組，A 組僅加入200 μL 含5%胎牛血清的DMEM/F12 培養基，D 組加入200 μL 含 100 μmol/L 白消安的 DMEM/F12 培養基，培養48 h 后，用胰酶消化后，80%冷甲醇固定，過夜，用Annexin V/PI染色，采用流式細胞分析儀檢測兩組細胞周期。

1.6統計學方法本研究用SPSS 19.0 軟件處理，計量資料采用xˉ±s表示，符合正態分布計量資料，一般多組間比較采用單因素方差分析，多時點觀測資料的比較采用重復測量方差分析，多組之間兩兩比較采用LSD-t檢驗的方法；計數資料的比較采用χ2檢驗的方法，當P＜0.05時，認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1四組U87膠質瘤干細胞吸光度比較培養24 h 后，四組U87 膠質瘤干細胞吸光度比較差異無統計學意義（P＞0.05）；培養48 h、72 h 后，B、C、D 組U87膠質瘤干細胞吸光度低于A組（P＜0.05），且B、C、D 組 U87 膠質瘤干細胞大小明顯小于 A 組；培養48 h、72 h后，B、C、D組U87膠質瘤干細胞吸光度比較差異無統計學意義（P＞0.05）。具體數據見表1；代表性圖片見圖1。

2.2四組U87膠質瘤干細胞凋亡情況比較C 組U87膠質瘤干細胞Bax、Caspase-3、Bax/Bcl-2的吸光度值、陽性細胞表達率高于A、B 組（P＜0.05）；D 組U87膠質瘤干細胞Caspase-3、Bax/Bcl-2的吸光度值、陽性細胞表達率高于A、B組（P＜0.05）。見表2。

表1 四組U87膠質瘤干細胞吸光度比較/xˉ±s

圖1 四組U87膠質瘤干細胞代表性圖片（標尺＝100 μm，中心細胞×100，右上角特寫×400）：A～D分別為A、B、C、D組

2.3兩組U87膠質瘤干細胞周期比較A 組、D 組處于G1 期細胞分別占8.20%、3.22%，處于G2/M 期細胞分別占16.07%、12.18%，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；A組、D組處于G0/G1期細胞分別占52.27%、58.85%，處于S 期細胞分別占23.36%、25.75%，兩組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

研究統計發現，腦膠質瘤為惡性程度較高的一種原發性腦腫瘤，約占顱內腫瘤的45%［4］。根據膠質瘤的病理及免疫組化，可分為星形細胞瘤、少突膠質細胞瘤［5］。研究發現，致癌基因高表達、抑癌基因失活、細胞信號通路調節，均可影響膠質瘤的發生、發展［6］。因此，相關致癌基因及其病理機制的研究在膠質瘤的診治中具有重要的意義，成為膠質瘤研究熱點。

腫瘤干細胞學說的提出，促進學者了解腫瘤發生機制［7-8］，同時為探尋治療腫瘤的藥物提供依據。Ignatova等［9］首次發現膠質瘤中存在膠質瘤干細胞，隨后大量研究證實實體膠質瘤組織及細胞中，存在膠質瘤干細胞。齊玲等［10］研究發現，通過分離人新鮮腦腫瘤，直接進行培養，能夠獲得腦腫瘤干細胞；而該類細胞的存在，可能是導致腫瘤發生、耐藥、復發的原因。雖然膠質瘤干細胞在膠質瘤實質中占的比例較低，但是在腫瘤的生長、轉移、復發、耐藥中起著關鍵作用［11-12］。

表2 四組U87膠質瘤干細胞凋亡情況比較/xˉ±s

目前，學者分離培養膠質瘤干細胞主要有兩種方法：（1）利用流式細胞儀或者免疫磁珠篩選CD133陽性細胞或ABCG2陽性細胞，得到含量較高的膠質瘤干細胞；（2）用無血清培養基培養膠質瘤細胞，采用非膠質瘤干細胞凋亡，而膠質瘤干細胞成球的特性，進行膠質瘤干細胞篩選［13-14］。

白消安為一種甲烷磺酸類的雙功能烷化劑，研究表明，白消安具有清除骨髓作用，但目前尚無證據證實白消安對成熟的淋巴細胞有殺傷作用，因此，有學者認為，在進行干細胞移植治療血液疾病時，可采用白消安聯合環磷酰胺進行異基因造血干細胞移植預處理；若環磷酰胺劑量不足時，可引起早期移植排斥，而白消安劑量不足時，可引起晚期移植排斥［15-17］。李程程等［18］研究發現，白消安可降低機體外周血白細胞數目，同時降低造血干細胞、造血祖細胞的比例及數目，誘導造血干細胞損傷，建立造血干細胞損傷模型，為探尋造血干細胞損傷機制提供基礎。

本次研究發現，高濃度白消安可抑制U87膠質瘤干細胞增殖，但具體機制需進一步研究。Caspase-3為凋亡過程中關鍵蛋白酶之一，起著重要的樞紐作用；是凋亡過程中最關鍵的執行蛋白酶，起著重要樞紐作用；Bcl-2 在細胞凋亡過程中扮演重要角色，其高表達，可抑制細胞凋亡；Bax在細胞凋亡過程中的作用與Bcl-2相反，二者產生負反饋調節，進而影響細胞的存活，通過計算Bax/Bcl-2 值，可了解細胞生存狀況［19-20］。本次研究結果顯示，B、C、D 組細胞吸光度低于A 組，Caspase-3、Bax、Bcl-2 的吸光度值及陽性表達率升高，G1 期、G2/M 期細胞所比例較高；結果說明白消安可抑制U87 膠質瘤干細胞的增殖，促進其凋亡，并且呈現一定量效關系，機制可能與白消安上調Bcl-2、Bax、Caspase-3表達有關。