基于水分活度測定的發酵胡蘿卜濃縮汁細菌檢測方法

楊曉莉 李翠 謝毓華 繩金房

摘要：目的：從水分活度測定以及影響水分活度的關鍵限值（溫度和pH）出發，研究發酵胡蘿卜濃縮汁細菌生長情況。方法：選取山東綠維胡蘿卜濃縮汁，由該發酵胡蘿卜濃縮汁剝離提純的萄球菌、銅綠假單細胞菌、大腸埃希氏菌、腐生酵母菌，用1mol/L的鹽酸和氫氧化鈉對胡蘿卜濃縮汁的酸堿度進行調整，以80%的甘油溶液調整水分活度，測定細菌最大生長率、生長遲滯時間、細菌生長條件理論最低值以及細菌生存概率。結果：水分活度，以及影響水分活度的溫度和pH兩個關鍵限值，都是細菌滋生的必要條件，當溫度設置在37℃時，隨著水分活度的不斷增加，以及影響水分活度的關鍵限值pH值增加，發酵胡蘿卜濃縮汁的葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單細胞菌的逐漸增加，生長速率呈上升趨勢，3種細菌的最低水分活度是097，水分活度的最低溫度以及最低pH值分別是453℃和393;影響發酵胡蘿卜濃縮汁風味的腐生酵母菌隨著水分活度的不斷升高，最大生長率不斷提升，遲滯時間逐漸縮短。結論：水分活度，以及影響水分活度的關鍵限值溫度和pH值在細菌滋生的時候相互作用，水分活度越高，影響水分活度的關鍵限值溫度和pH越高，發酵胡蘿卜濃縮汁細菌的生長速率越快，存活率越好。

關鍵詞：水分活度;細菌;檢測;生長速率;遲滯時間;生存概率

由乳酸菌制成的發酵胡蘿卜濃縮汁營養含量高，能夠更好地調節人體免疫功能[13]。發酵胡蘿卜濃縮汁在出廠前都會在不破壞液體原有菌落的基礎上進行非熱殺菌處理，但是此種殺菌技術效果并不好，在其他環節如果控制不當，很容易滋生細菌。水分活度已經被發達國家廣泛應用于食品范疇內，長期研究表明，水分活度數值與細菌繁殖數量有對應關系，是延長貨架期反映食品腐敗性的關鍵參數[45]。研究人員通過研究水分活度的關鍵限值對應的各微生物生長發育情況[68]，得到細菌繁殖的速度受到水分活度影響。因此，本研究從水分活度以及影響水分活度的關鍵限值（溫度和pH）出發，對發酵胡蘿卜濃縮汁細菌檢測進行研究。

1材料與方法

11實驗菌株

選取山東綠維胡蘿卜濃縮汁，市場售賣直投式發酵劑，乳酸菌菌種。用1mol/L的鹽酸和氫氧化鈉對胡蘿卜濃縮汁的酸堿度進行調整，以80%的甘油溶液調整水分活度。將由發酵胡蘿卜濃縮汁剝離提純并經過VITEK2 Compact鑒定的葡萄球菌、銅綠假單細胞菌、大腸埃希氏菌、腐生酵母菌，培養于蛋白胨肉湯斜面培養基，貯藏于冰箱內設置溫度為4℃，為保持活力，每月傳代1次。

12儀器及試劑

萊希特水分測試儀，深圳市萊希特科技有限公司;TS130酸度計，鄭州凱達環保科技有限公司;UV1902PC分光光度儀，上哈奧析科學儀器有限公司;甘油，山東魯里亞新材料公司。

13方法

131細菌生存概率測定在盛有水分活度和pH已經調整過的9mL發酵胡蘿卜濃縮汁的試管中滴入1mL經過發酵胡蘿卜濃縮汁稀釋過的細菌培養液，此時菌液濃度為502*103CFU/mL，設定不同溫度培養48h，進行吸光度值測定，假如發酵胡蘿卜濃縮汁經增菌液培養前后的吸光度值差值小于0002（±0002是分光光度計下的相對誤差范圍），那么這些細菌就能生存，如果沒有明顯差別，那么這些細菌就不能生存（以2值變量0表示）。

132細菌生長條件理論最低值和生長遲滯時間確定模型處于對數生長期時，微生物的整體發育如同化學反應時的一級催化反應，具體為某時間點的細胞數量（或質量）與細胞數量（或菌體質量）的增長速率的比是常數。當對數生長為t0時，測出的細胞數目是N0;當對數生長為t時，測出的細胞數目是Nt，通過式（1）可得出培養基內的細菌生長速率常數為μ。

μ=（1gNt-1gN0）tt0*2 303（1）

設定生長溫度最低值為Tmin，在pH 65、水分活度為099時，培養基中的5種不同細菌在不同溫度條件下的生長速率，采用SPSS V260軟件統計數據，Ratkowsky模型參數在使用迭代計算時會運用LevenbrrgMarquardt過程，從而得出式（2）：

μmax=b（TTmin）{1exp[cTTmax）]}（2）

式（2）中，細菌最高生長速度為μmax，細菌理論最高生長溫度為Tmax，最低生長溫度為Tmin，，模型參數分別為b和c。最低水分活度和pH值分別為Awmin和pHmin，細菌最大生長率，修正公式如式（3）：

μmax=a（AwAwmin）*（pHpHmin）*（TTmin）2（3）

導入SPSS V260軟件，Ratkowsky模型參數在使用迭代計算時會運用LevenbrrgMarquardt過程迭代計算[9]，得出pH理論最低值和限制微生物生長的水分活度分別為Tmin和pHmin。

生長遲滯時間為式（4），其中模型系數分別為a和d。

λ=d*（AwAwmin）*（pHpHmin）*（TTmin）2 （4）

式（4）中，Awmin是限制細菌生長的水分活度，pHmin是pH的理論最低值，Tmin是溫度理論最低值。應用響應面模型，最大生長速率為式（5），生長遲滯期為式（6）。

μm=Iμ+m1T+m2pH+m3Aw+m4T2+m5pH2+m6A2w+m7TpH+m8TAw+m9pHAw （5）

λm=Iλ+l1T+l2pH+l3Aw+l4T2+l5pH2+l6A2w+l7TpH+l8TAw+l9pHAw

（6）

式（5）～（6）中，模型常數分別為Iμ和Iλ，模型系數分別為m19和l19。

2結果與分析

21葡萄球菌、銅綠假單細胞菌、大腸埃希氏菌生存概率

觀察發酵胡蘿卜濃縮汁的葡萄球菌、銅綠假單細胞菌、大腸埃希氏菌生存概率、水分活度對細菌繁殖的影響。實驗設計采用三因素五水平CCD方案，參照水分活度范圍、發酵胡蘿卜濃縮汁的儲藏溫度以及限制細菌生長條件最低值等因素。當水分活度較低，同時影響水分活度的溫度和pH兩個關鍵限值都較低的情況下，3種發酵胡蘿卜濃縮汁細菌的生存概率也較低，從表1可看出，當水分活度為096，同時影響水分活度的溫度僅為10℃、pH為46時，葡萄球菌、大腸埃希氏菌及銅綠假單細胞菌生存概率幾乎為0;當水分活度為0963，影響水分活度的溫度為26℃、pH為46時，細菌生存概率為100%。由此可見，水分活度，以及影響水分活度性能的兩個關鍵限值溫度以及pH相互作用相互影響，是細菌滋生的必要條件（表1）。

22不同水分活度下細菌生長速率

從表2可以看出，當溫度設置在37℃，在不同水分活度以及不同影響水分活度的pH情況下，發酵胡蘿卜濃縮汁3種細菌的生長速率受到不同影響。隨著pH值與水分活度的不斷增加，3種細菌的生長速率逐漸升高。將通過表2得出的生長速率數值與已知的最低生長溫度理論值Tmin帶入式（3），得到發酵胡蘿卜濃縮汁3種細菌存活的最低水分活度、最適宜溫度和最低pH。從表3可以看出，發酵胡蘿卜濃縮汁3種細菌的存活最低水分活度都為093左右;葡萄球菌及大腸埃希氏菌的最低存活溫度分別為831、761℃，而銅綠假單細胞菌無論是最低溫度還是最低pH值都低于另兩種細菌，說明要確保3種細菌的出現，最大水分活度要保證為097，同時要確保影響細菌水分活度的溫度最低為453℃、pH最低為393。在試驗中，銅綠假單細胞菌的最低水分活度較高，而大腸埃希氏菌和葡萄球菌的最低水分活度較低，原因是此實驗以甘油作為水分活度調節劑，甘油更易滲入細胞內部，降低細胞內水分活度更快，對細胞器及大分子物質起到保護作用。

23腐生酵母菌最大生長速率和遲滯時間

發酵胡蘿卜濃縮汁中的腐生酵母菌是影響發酵胡蘿卜濃縮汁風味的主要微生物之一。如果水分活度，以及影響水分活度的溫度和pH等條件合理，腐生酵母菌就會批量繁殖，產生代謝副產物。腐生酵母菌是一種腐敗菌極易使發酵胡蘿卜濃縮汁腐化變質腐，測試其在24℃情況下，不同水分活度以及不同影響水分活度的pH情況下的生長速率。分析表4可得，在24℃時，不同水分活度以及不同影響水分活度的pH條件下，測得的發酵胡蘿卜濃縮汁的腐生酵母菌最大生長速率和遲滯時間有所不同，隨著水分活度和pH的不斷升高，腐生酵母菌的最大生長率不斷提升，而遲滯時間逐漸縮短。

3討論

水分活度一般指自由水，每種微生物滋生所需的最低水分活度不同[1012]。

本研究顯示，當水分活度逐漸提高，且影響水分活度性能的溫度和pH逐漸提高，則發酵胡蘿卜濃縮汁的葡萄球菌、銅綠假單細胞菌、大腸埃希氏菌、腐生酵母菌細菌生長情況越好。在水分活度為099時，細菌生長速率最快。其中，葡萄球菌的最低生存值為溫度831℃、

pH 421、水分活度0937;銅綠假單細胞菌的最低生存值為溫度453℃、pH 421、水分活度094;大腸埃希氏菌最低生存值為溫度761℃、pH 414、水分活度0937。由此可知，如果發酵胡蘿卜濃縮汁的水分活度低于093、pH低于39、所處環境溫度低于4℃，以上3種細菌將很難成活。且本研究發現，要確保3種細菌的出現，最大水分活度要保證為097，同時要確保影響細菌水分活度的溫度最低為453℃、pH最低為393。

水分活度和pH越大，發酵胡蘿卜濃縮汁腐生酵母菌的最大生長率越快，遲滯時間越短。臨界條件下，發酵胡蘿卜濃縮汁中的大腸埃希氏菌、葡萄球菌和銅綠假單細胞菌在不同水分活度、溫度和pH間具有相互作用，從本研究數據中可以看出，水分活度與pH、溫度在細菌的生存極限影響中相互作用[1314]，假如細菌的生存溫度逐漸降低，在水分活度和pH條件較高的情況下，細菌的生長受到抑制，由此可見，發酵胡蘿卜濃縮汁要盡量貯存于低溫環境[15];如果將水分活度和pH條件降低，那么溫度可以相對升高，發酵胡蘿卜濃縮汁就可以常溫保存了，這樣不但節約了貯存和運輸成本，也降低了能源消耗。

4結論

本研究從水分活度測定出發，構建發酵胡蘿卜濃縮汁細菌生長速率和生長概率模型，通過水分活度以及影響水分活度的兩個關鍵限值溫度和pH，檢測發酵胡蘿卜濃縮汁內細菌生長情況，研究發酵胡蘿卜濃縮汁的葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單細胞菌的生成概率和生長速率，以及腐生酵母菌的最大生長概率以及遲滯時間，發現發酵胡蘿卜濃縮汁各種細菌的生存概率，同水分活度以及影響水分活度的兩個關鍵限值溫度和pH影響，溫度和水分活度越高，細菌生存概率越高。◇

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