自體富血小板凝膠的制備及其生長因子分析

王鑫 董春英 趙玉慧 王麗娜

【摘要】目的：分析不同離心法制備自體富血小板凝膠的方法，通過改變離心速度，分析不同離心力對PLT濃度的影響;以及全血和APG中5種生長因子的濃度。方法：對20例難治性糖尿病皮膚潰瘍患者應(yīng)用APG治療，以3種離心速度制備PRP。采用全自動血細胞分析儀測定各組全血及PRP中PLT數(shù)量，酶聯(lián)免疫吸附法測定全血及APG中PDGF-BB、VEGF、IGF-1、EGF、TGF-生長因子濃度。結(jié)果：B組PRP中PLT計數(shù)最高（P<0.05），PLT回收率也較高。APG中PDGF-BB、EGF、IGF-1和TGF-（P<0.05）的濃度均高于全血中的濃度，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。20例患者經(jīng)APG治療后，16例竇道治愈率為88.9%。結(jié)論：制備PRP的最佳方法是先離心313×g 4min，再離心1252×g 6min，APG中生長因子濃度高于全血，PL值與PDGF-BB和TGF-濃度成正相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】自體富血小板凝膠;制備;生長因子

【中圖分類號】R94??????????????????????? 【文獻標(biāo)識碼】B????????????????????????? 【文章編號】2096-7225（2020）03-0001-01

1資料與方法

1.1一般資料

本次納入20例患者，其中背部深部潰瘍4例，骶尾部褥瘡3例，髖部褥瘡3例，小腿潰瘍2例，足部潰瘍8例。合并竇道18例，骨髓炎及死骨形成2例。若一次治療效果不滿意，兩周后再行APG治療。

1.2主要試劑與儀器

凝血酶;10%葡萄糖酸鈣;鼠抗人TGF-、VEGF、PDGF-BB、EGF、IGF-1等ELISA試劑盒。電子天平;真空采血管;XE2100全自動血細胞分析儀;注射器;低速離心機;-80℃冰箱;低溫離心機;MK3酶標(biāo)測試儀。

1.3不同的離心方法制備PRP

根據(jù)離心方法的不同，將患者分為A、B、C三組。根據(jù)潰瘍面積與竇體積抽取外周靜脈血。取全血3mL，其中2mL用于全自動血細胞分析儀進行血細胞計數(shù)，1mL保存于-80℃冰箱中進行生長因子測定。其余全血用三種方法離心。A組：全血529×g離心4min，將界面附近約1mm的上血漿和RBC轉(zhuǎn)移到另一離心管中;再以854×g離心6min后，可見底部薄層紅RBC上沉積有白色膜狀物質(zhì)，即PLT沉積層;上部為含有極少量未沉淀PLT的血漿層。上部大部分血漿是用巴氏管吸取，其余所需血漿和血細胞成分靜置30min后振搖離心管，使RBC及PLT重懸在剩余血漿中，即得PRP，制備6次。B組：制備方法與A組相同，改變離心速度與時間，先用313×g離心4min，再用1252×g離心6min，共5次。C組：制備方法與A組相同，改變離心速度及時間，先用176×g離心5min，再用1252×g離心5min，共5次。每種方法取PRP 2mL進行血細胞計數(shù)，余制備APG。

1.4APG的制備與應(yīng)用

將PRP與凝血酶和鈣劑按10：1的比例混合得到APG，取本品1mL于-80℃冰箱中保存，測定生長因子濃度。在標(biāo)準(zhǔn)治療的基礎(chǔ)上，將剩余的APG用雙通注射器均勻噴灑在潰瘍表面或深竇道內(nèi)，表面覆蓋凡士林油紗48～72h;15d后潰瘍?nèi)庋拷M織生長不良，進行第二次APG治療。

1.5測定血細胞及APG中生長因子的濃度

將保存在-80℃冰箱中的APG及全血樣品在室溫下解凍，酶聯(lián)免疫吸附法測定全血及APG中PDGF-BB、VEGF、IGF-1、EGF、TGF-的生長因子濃度。

2結(jié)果

2.1PLT計數(shù)與生長因子濃度的相關(guān)性分析。Pearson相關(guān)分析顯示，PLT數(shù)與PDGF-BB、TGF-濃度呈正相關(guān)，但與其它三種生長因子濃度無相關(guān)性。

2.2臨床治療結(jié)果。20例患者潰瘍面積明顯小于治療前（P<0.05）。18例合并竇道患者中，16例經(jīng)APG治療后痊愈，治愈率為88.9%。其中，8例經(jīng)1次APG治療后3d完全封閉;第一次治療后6例竇道體積明顯縮小，第二次治療后3d竇道完全封閉;第三次治療后1例竇道封閉愈合;2例骨髓炎伴有死骨形成的患者，在死骨未清除前行APG治療二次后竇道無變化，后經(jīng)外科切除壞死骨質(zhì)后痊愈;1例左髖部竇道在二次APG治療后竇道體積無明顯變化。

3討論

當(dāng)前，PRP的制備方法主要有血漿分離置換法及離心分離法。其中，血漿分離置換法是利用多功能醫(yī)用血成分自動分離設(shè)備單獨采集PLT制備濃縮PLT成分。該方法自動化程度高，PLT純度及濃度高，但設(shè)備較昂貴，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。為了尋找合適的離心速度，提高PLT的富集率，研究了三種離心方法對PLT富集效果的比較。然而，不同方法制備的PRP中PLT數(shù)量有很大差異。

APG治療的主要機制是PLT被激活后釋放多種高濃度生長因子，比較全血與APG中TGF-、VEGF、PDGF-BB、EGF、IGF-1等生長因子的濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)APG中PDGF-BB、EGF、IGF-1、TGF-的濃度明顯高于全血（P<0.05），VEGF的濃度也有升高;相關(guān)分析表明，PLT計數(shù)與PDGF-BB、TGF-的濃度成正相關(guān)。APG中TGF-、VEGF、PDGF-BB和EGF的濃度顯著升高，而IGF-1的濃度與全血相比無顯著性差異，TGF-濃度與PLT數(shù)量成正相關(guān);另外，APG和PLT缺陷凝膠中PDGF-AB、EGF、TGF-、VEGF、肝細胞生長因子（HGF）、TGF-1，發(fā)現(xiàn)在PRP中PDGF-AB及TGF-濃度顯著升高，并與PLT數(shù)量成正相關(guān);但VEGF、EGF、HGF和IGF-1均未升高。本研究比較了細胞培養(yǎng)6d前后培養(yǎng)液中生長因子的濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)后TGF-、VEGF、HGF濃度明顯升高，IGF-1濃度無明顯變化，PDGF-AB、EGF濃度降低。以上結(jié)果表明，大多數(shù)生長因子的濃度隨著離心后PLT濃度的增加而升高。然而，PLT激活和釋放生長因子是一個復(fù)雜的過程，APG中大量生長因子未完全釋放，PLT的增加并不能立即升高所有生長因子的濃度，PLT中生長因子的釋放順序及調(diào)控機制有待進一步研究。

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項目名稱：黑龍江衛(wèi)生計生委科研（項目編號：2017-491）