MAP3K1-3UTR基因表達(dá)載體的構(gòu)建及雙熒光素酶技術(shù)驗證

張雪婷?莫榮纖?張濤杰

摘要：目的 通過雙熒光素酶技術(shù)驗證MAP3K1-3UTR基因表達(dá)的作用，從而研究凋亡因子對綿羊卵泡閉鎖和凋亡的分子機(jī)制。方法 根據(jù)NCBI在線設(shè)計引物獲取目的基因，將雙熒光素酶載體分別插入MAP3K1基因野生型（MAP3K1-3UTR-WT）和突變型（MAP3K1-3UTR-MU）片段，構(gòu)建psicheck2-MAP3K1-3UTR-WT和psicheck2-MAP3K1-3UTR-MU雙熒光素酶報告質(zhì)粒，將重組之后的雙熒光素酶報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，檢測雙熒光素酶的活性。結(jié)果 經(jīng)過酶切和基因測序技術(shù)，成功構(gòu)建MAP3K1-3UTR-WT和MAP3K1-3UTR-MU的雙熒光素酶報告質(zhì)粒。psicheck2-MAP3K1-3UTR野生型與psicheck2-MAP3K1-3UTR突變型相比，熒光素酶活性明顯降低。結(jié)論 MAP3K1-3UTR基因可能與綿羊卵泡細(xì)胞的閉鎖和凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞：MAP3K1;卵泡顆粒細(xì)胞;基因表達(dá);雙熒光素酶

引言

卵泡是雌性動物繁殖的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，卵泡是由卵母細(xì)胞及其周圍顆粒細(xì)胞（granulosa cells，GCs）組成。顆粒細(xì)胞是構(gòu)成卵泡的最大細(xì)胞群，它們以自分泌和旁分泌的方式調(diào)節(jié)卵泡的生長、發(fā)育和成熟，顆粒細(xì)胞可被認(rèn)為是卵泡的支持細(xì)胞。顆粒細(xì)胞可促進(jìn)卵巢合成和分泌抑制素、雌激素以及孕激素，為卵母細(xì)胞的成熟提供微環(huán)境，并維持黃體功能[2，3]。有研究表明，當(dāng)顆粒細(xì)胞能力減弱或凋亡時，激素和生長因子的分泌將減少，甚至發(fā)生卵泡閉鎖 [4]。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK家族）調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、凋亡等多種生理病理過程，所有真核細(xì)胞都能表達(dá)，由三類蛋白激酶MAP3K-MAP2K-MAPK組成。MAP3KS一共有24種（MAP3K1至MAP3K21加上RAF1，BRAF和ARAF） [1]。MAP3K1是其中一種分子量為196-kDa的絲氨酸/蘇氨酸激酶，它可以被各種刺激和細(xì)胞應(yīng)激（包括生長因子，細(xì)胞因子和微管破壞）激活，這是MAPK家族級聯(lián)激活第一步[6]。其編碼MEKK1蛋白是MAPK信號通路中的重要一員[5]，調(diào)控JNK、ERK1/2、P38等信號通路[7，8]。細(xì)胞凋亡受到生殖激素、微小RNA（microRNA， miRNA）、細(xì)胞因子和凋亡相關(guān)因子等因素的影響，其生殖激素（如FSH、褪黑素、E2和LH等）對卵泡發(fā)育和凋亡起主要作用。然而，這些凋亡因子對綿羊卵泡閉鎖和凋亡有何作用尚不清楚。因此本文通過構(gòu)建MAP3K1-3UTR基因表達(dá)載體來研究其在細(xì)胞凋亡中的分子機(jī)制。

一、實驗?zāi)康?/p>

構(gòu)建MAP3K1-3UTR基因的psicheck2-MAP3K1-3UTR表達(dá)載體，來研究凋亡因子對綿羊卵泡閉鎖和凋亡的分子機(jī)制。

二、實驗材料與方法

（一）實驗材料

靶基因名稱：MAP3K1基因。

表達(dá)載體：psicheck2載體。

293T細(xì)胞株，E.coli DH5α Chemical Competent Cell（上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司），高糖DMEM、小牛血清（美國Hyclone公司），限制性內(nèi)切酶（美國NEB公司），ClonExpress TM Ⅱ One Step Cloning Kit（中國南京，Vazyme）， T4 DNA Ligase、PrimeSTAR HS DNA polymerase（日本Takara 公司），POLO deliverer 3000（上海瑞賽生物技術(shù)有限公司），TRIzol Reagent（invitrogen），

（二）實驗步驟

1.引物設(shè)計

針對MAP3K1-3UTR基因的CDS區(qū)序列NCBI在線設(shè)計并合成PCR 引物（見表1）。

2.目的基因獲取化學(xué)（化學(xué)合成）

根據(jù)NCBI上獲得的MAP3K1-3UTR基因的CDS區(qū)序列，設(shè)計并化學(xué)合成涵蓋psicheck2載體結(jié)合位點的MAP3K1基因野生型（MAP3K1-3UTR-WT）和突變型（MAP3K1-3UTR-MU）片段。

3. 雙熒光素酶報告基因載體構(gòu)建

（1）目的基因及目的載體的酶切

將目的基因和目的載體用xhoI和NotI分別進(jìn)行酶切，酶切體系如下：

37℃酶切4-5小時后，電泳分離酶切片段，可以看到在418bp位置處出現(xiàn)兩個特異性條帶與目的基因相符，切膠回收目的片段。如圖二

（2）目的片段的與目的載體的連接

使用T4 DNA ligase 連接上述酶切后的PCR產(chǎn)物及目的載體，連接體系如下：

22 oC連接1小時。將10ul連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于含抗性的LB平皿，在37oC下培養(yǎng)過夜。次日，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR，PCR擴(kuò)增體系及循環(huán)程序如下：

將PCR鑒定呈陽性的克隆接到LB液體培養(yǎng)基中，搖菌過夜，次日抽提質(zhì)粒。將菌落PCR呈陽性的克隆送測序，并進(jìn)行序列比對。

4.雙熒光素酶載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

制備293T細(xì)胞懸液，接種于12孔培養(yǎng)板，在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度約為 80%，將psicheck2-MAP3K1-3UTR載體（野生型和突變型）質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。

三、實驗結(jié)果

（一）psicheck2載體圖譜如下：

（二）目的片段酶切

泳道1：目的片段MAP3K1-wt 酶切;

泳道2：目的片段MAP3K1-mu 酶切;

泳道3：Marker DL5000

（三）重組克隆的菌落PCR鑒定

泳道1：Marker DL2000

泳道2-8：基因全長引物對重組子PCR擴(kuò)增（MAP3K1-WT）;

泳道9-15：基因全長引物對重組子PCR擴(kuò)增（MAP3K1-MU）

（四） psicheck2-MAP3K1-3UTR載體對293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果

48小時后，熒光表達(dá)強(qiáng)度趨于穩(wěn)定狀態(tài)，在倒置熒光顯微鏡下觀察。psicheck2-MAP3K1-3UTR野生型與psicheck2-MAP3K1-3UTR突變型相比，熒光素酶活性明顯降低。

psicheck2-MAP3K1-3UTR載體（野生型）

psicheck2-MAP3K1-3UTR載體（突變型）

四、討論

卵泡閉鎖發(fā)生的原因之一是顆粒細(xì)胞的凋亡，這在許多動物身上已得到了證實。而卵泡閉鎖會對卵巢的發(fā)育產(chǎn)生一定的影響，從而影響到動物的繁殖。MAP3K1-3UTR基因指導(dǎo)細(xì)胞的生長，分化，遷移，對顆粒細(xì)胞是否會發(fā)生凋亡產(chǎn)生重要影響。

MAP3K1-3UTR基因所編碼的MEKK1蛋白具有重要的生物學(xué)功能，是MAPK家族幾種傳導(dǎo)信號的上游調(diào)節(jié)因子[9]，幾種研究表明MAP3K1-3UTR決定著細(xì)胞的命運，雙熒光素酶報告數(shù)據(jù)顯示抑制MAP3K1-3UTR基因的表達(dá)后，雙熒光素酶的活性明顯降低，說明該基因能夠控制細(xì)胞的能力。為之后進(jìn)一步研究細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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作者簡介：

張雪婷（1999-06-01），河北省石家莊市，單位：西北民族大學(xué)，研究方向：動物生殖生理（自然科學(xué)類）。

莫榮纖（1999-03-），貴州省凱里市，單位：西北民族大學(xué)，研究方向：生殖生理。

通訊作者：張濤杰（1983-12-），甘肅臨洮，臨床獸醫(yī)學(xué)，西北民族大學(xué)。

項目名稱：miRNA-let-7b對卵巢癌細(xì)胞株SKOV3的增殖的影響以及作用機(jī)制

項目編號：XBMU-BYL19140.