評估霉菌毒素脫毒產品的體外方法

劉云福

摘? 要：霉菌毒素污染飼料是一個世界性的安全問題，給全球各地的經濟造成了巨大損失。本文簡要介紹了減少霉菌毒素污染的可行性產品以及體內和體外檢測方法。

關鍵詞：霉菌毒素;吸附劑;生物轉化脫毒劑;胃腸道模型

霉菌毒素污染飼料是一個世界性的安全問題，給全球各地的經濟造成了巨大損失。

霉菌毒素是霉菌產生的一類穩定的小分子次級代謝產物，一旦生成極難被清除。人或動物采食被霉菌毒素污染的食物或日糧后健康會受到不良的影響，可出現畸形、癌癥、雌激素樣刺激或者免疫抑制。

用物理或化學方法處理霉菌毒素通常會影響飼料的營養價值。這也是為什么生物學方法通常被認為是減少動物攝入霉菌毒素的最可靠方法。

1? 降低霉菌毒素污染的可行性

在飼料中添加脫毒劑的目的是降低霉菌毒素的生物利用率，從而減少動物攝入的霉菌毒素數量，防止霉菌毒素在血液及組織中大量擴散。

脫毒劑通?？煞譃閮深悾好咕舅匚絼┖蜕镛D化脫毒劑。

這些產品吸附和降解霉菌毒素的能力必須進行測試。在進行體內試驗之前，體外分析是篩選和選擇脫毒劑的一個強有力的工具;體內試驗的成本昂貴，應根據3R[研究所用動物的替換（Replacement）、減少（Reduction）和精選（Refinement）]原則，盡可能減少體內試驗。

科研人員已經成功開發出多種霉菌毒素檢測模型，從簡單的濃度測定到更為精細的模擬動物胃腸道的模型。本文的目的是調查現有的體外測試方法，以評估霉菌毒素解毒劑的功效，并確定最佳的預篩選策略。

2? 霉菌毒素脫毒劑

目前尚無可以評估霉菌毒素脫毒劑功效的國際統一標準。在歐盟委員會發布的386/2009號委員會條例中，霉菌毒素脫毒劑在功能性飼料添加劑中被定義為“可減少霉菌毒素對飼料污染的物質，該物質可抑制或減少動物對霉菌毒素的吸收，促進霉菌毒素的排泄或改變其作用方式”。該法規所列出的飼料添加劑以化學分子式、種類和分析方法等方式進行精確定義，并在數期歐盟公報的若干法律文本中進行了詳細說明。

由于脫毒劑的理化性質和結構性，用于評估它們對霉菌毒素脫毒能力的作用機制和檢測方法要視脫毒劑類型的不同而有所區別。

2.1 霉菌毒素吸附劑

霉菌毒素吸附劑也叫霉菌毒素結合劑，是一類以硅酸鹽為主要成分的無機化合物，或者是一類碳基類有機聚合物。無機類吸附劑包括天然的黏土產品（水合鋁硅酸鈉鈣、沸石和膨潤土）以及合成多聚體，有機類吸附劑包括一些酵母細胞壁成分、活性炭、合成多聚體、腐殖質和日糧纖維。

吸附劑能夠在動物的胃腸道中吸附霉菌毒素且不會解離。通過這種方式，霉菌毒素-吸附劑復合體能夠與糞便一起排出體外，因此可以減少動物吸收的霉菌毒素數量。

不同類型分子間的交互作用可能參與相同的吸附過程（疏水性、靜電吸附、分子識別）。

2.2 生物轉化脫毒劑

霉菌毒素生物轉化脫毒劑含有大量的微生物和能夠降解或中和多種霉菌毒素的純合酶，如細菌、酵母、真菌、原生動物和酶。

在選擇脫毒劑和吸附劑時，必須同時觀察產品的定性和定量特性（如親和力、容量和選擇性等）。定量特性應盡可能以能夠比較吸附劑并可預測不同條件下功效的方式來表述。

3? 試驗性研究回顧

霉菌毒素的體外吸附預備試驗被認為是篩選有潛力的霉菌毒素脫毒劑的最佳方法。實際上，如果脫毒劑在體外試驗中沒有表現出吸附作用，那么它很難在動物體內發揮吸附作用。

就霉菌毒素吸附劑而言，要測定其對霉菌毒素解毒的能力，需要進行不同類型的試驗。

3.1 “單一濃度”檢測法

“單一濃度”檢測法是體外試驗中應用最廣泛的方法，加入特定濃度的脫毒劑后，可以測定固定濃度下水性介質中對純的合成霉菌毒素的吸附作用。這種方法操作簡單、成本低且不會浪費脫毒劑，對具有類似作用機制的吸附劑進行比較非常有效。然而，檢測結果取決于吸附劑的濃度，由于不是真實的胃腸道環境，很難將結果與動物體內真實的情況關聯起來。

3.2 “等溫線”檢測法

“等溫線”檢測法的目的是獲得一條能夠說明相對于介質中最早的霉菌毒素濃度的單位重量吸附劑所吸附霉菌毒素量的曲線。該檢測通常能夠給出恒溫下某一濃度的吸附劑對不同濃度的純霉菌毒素的吸附曲線，也可以反推。

“等溫線”檢測法可以在水性介質中進行，也可以在存在或缺乏飼料基質的情況下進行。分析這些研究的結果常?？梢栽u估與霉菌毒素污染相關的基質是否會影響吸附劑的功效。

由于吸附研究考慮了吸收過程（平衡）的可逆性，因此能讓我們更好地了解吸附劑的功效。這被認為是可以測定霉菌毒素吸附劑總吸附能力的最佳分析方法之一。

相比“單一濃度”檢測法，這些方法操作更復雜，完成對照研究需要花費更多的時間，而且成本更高。

3.3 靜態胃腸道模型和動態胃腸道模型試驗

靜態胃腸道模型和動態胃腸道模型試驗是使用胃腸道模型進行的體外檢測法，這些模型盡量模擬豬胃腸道的生理條件，并考慮胃腸道中的消化酶及其濃度、pH、消化時間和鹽濃度等因素。

靜態胃腸道模型試驗在每個消化階段使用固定濃度的酶、鹽和膽汁酸，動態胃腸道模型試驗可以模擬與蠕動瓣膜相連的胃腸道（胃/瘤胃、十二指腸、結腸和回腸）的不同區段，并動態加入參與消化過程的消化液，它可能包含或不包含自然污染的飼料。

動態模型是能夠與動物體內的復雜性相比的最合適方法，還可以研究霉菌毒素的生物可接受性。實際上，這一研究可以通過模擬或者建立腸道屏障模型（細胞培養）來完成。

這種方法能夠測定霉菌毒素通過動物空腸上皮細胞（如豬小腸上皮細胞）的核纖層蛋白轉移，黏膜上皮單獨或與吸附劑一起接觸霉菌毒素。它也可以用于評估吸附劑對營養物質和（或）治療性物質的潛在干擾，還可以評估消化道上皮細胞的細胞膜完整性。

它為關于霉菌毒素代謝的經典體外研究提供了補充信息，這是最關鍵的一步。然而，這些研究需要良好的細胞生物學專業技術，并且成本昂貴。

霉菌毒素生物轉化脫毒劑對霉菌毒素的解毒性能通常利用“孵育研究”在體外進行評估。

在適合微生物生長的條件（溫度、攪動作用、有氧或者厭氧和生理合適的pH）下，微生物（細菌、真菌和酵母）與霉菌毒素在緩沖液中或者在特定肉湯培養液中混合。

一些不同的肉湯培養液利用復雜的基質（如瘤胃液、消化糜或含飼料的基質）進行了測試。對酶而言，孵育研究通常以同樣的方法在緩沖液中進行，孵育時間從幾分鐘到幾天不等。

要產生適合酶活性的最佳條件，溫度和pH可能也不同。需要考慮的重要因素是被測脫毒劑能降解霉菌毒素而不會產生具有潛在毒性作用的代謝物。

實際上，不一定每一種反應都會產生真正的解毒作用，因為代謝產生的產物可能具有比其母本化合物更大的毒性。例如，酵母在動物體內對玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）的生物轉化就屬于這種情況，它能夠將ZEN還原為α-玉米赤霉烯醇，后者會產生比ZEN更強的雌激素樣刺激。

4? 定量方面

無論被測試的脫毒劑和所用的研究條件如何，都需要使用霉菌毒素定量系統。最常用的方法是液相色譜法（Liquid Chromatograpy，LC）或者氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）以及免疫化學法，如酶聯免疫吸附試驗（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）。

分析工具的類型和樣品準備（提取和純化）所用的方法高度依賴于所測定的霉菌毒素的結構。

高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一種測定霉菌毒素的法定方法。此方法可與紫外分光檢測、熒光檢測、安培檢測或熒光分光光度檢測結合使用，正相HPLC和反相HPLC均可用于霉菌毒素的分離和純化。多種霉菌毒素有自然的熒光（如棕曲霉毒素），因此可以直接用HPLC-熒光法（HPLC-fluorescence，HPLC-FD）檢測。其他霉菌毒素，如伏馬菌素，可能需要上游定量步驟，如衍生作用，可以使用鄰苯二甲醛或9-（芴基甲基）氯甲酸酯進行。

氣相色譜法是一種適用于檢測揮發性和熱穩定性化合物的技術。通過將該系統鏈接到質譜儀（Mass-Spectrometry，MS）、氫火焰離子化檢測器或傅立葉變換紅外光譜儀來完成檢測。大多數霉菌毒素不具有揮發性，因此需要上游定量步驟。

層析色譜法被認為是檢測霉菌毒素最精確且最可靠的方法。然而，當體外試驗要檢測多個參數且分析次數很多時，昂貴的設備、必須由熟練的檢測人員操作以及分析所需的時間長可能是限制此方法應用的因素。

對檢測精確、靈敏、操作簡便、成本低和速度快的要求促使科研人員開發霉菌毒素定量檢測的免疫學方法。這些方法基于特定的單克隆抗體或多克隆抗體具有對特定霉菌毒素（抗原）的三維結構區別分類的能力研制而成。這些可以基于免疫親和柱分析法（Immunoaffinity Column-Based Analysis，IAC）或ELISA進行。最新方法通常用于商品試劑盒中（黃曲霉毒素試劑盒等，德國拜發公司）。

市場上銷售的數種商業試劑盒可用于體外檢測。它們通常是專為檢測一種霉菌毒素設計的，并且明確了應用范圍、特異性和交叉反應性、準確性和精密度以及測量范圍。

在考慮選擇進行體外檢測的試劑盒時，所有這些參數很重要。

除ELISA外，快速篩選測試和許多新技術（例如生物傳感器）也正在不斷涌現出來。

它們通常由一個生物來源的識別元件組成，當與目標分析物接觸時，識別元件會在信號轉導元件中產生一個可量化的響應。大多數信號轉導的機制是光學共振（比色、熒光和增強型化學發光）、電化學共振或表面離子體共振。如今，在這些有應用前景的技術中，大多數技術還處于開發階段，并且目前體外霉菌毒素脫毒劑研究還不能用來定量霉菌毒素。

5? 結論

目前，用脫毒劑來解決霉菌毒素污染問題有很大的發展潛力，并且許多體外檢測方法可用于評估它們的功效（圖1）。

從單一濃度檢測到模擬胃腸道更為復雜的模型，體外試驗研究被認為是一種有用的預篩選策略，可以選擇有應用前景的吸附材料或產品。