宏基因二代測序技術對醫院傳染性疾病防控的價值

林佳冰， 高曉東*， 胡必杰,2*， 陳 翔

1. 復旦大學附屬中山醫院醫院感染管理科，上海 200032 2. 復旦大學附屬中山醫院感染病科，上海 200032

醫院感染是指住院病人在醫院內獲得的感染，包括在住院期間發生的感染和在醫院內獲得、出院后發生的感染，但不包括入院前已開始或入院時已處于潛伏期的感染。醫院工作人員在醫院內獲得的感染也屬醫院感染[1]。而傳染性疾病較其他易發生院內感染的疾病而言，危害性更大。住院患者免疫力低下，易受感染，同時大量患者需進行氣管插管、導尿管或中心靜脈置管等感染高風險操作，一旦發生傳染性疾病的院內傳播，將帶來巨大不良影響。因此，對醫院內傳染性疾病患者進行早期診斷并采取針對性的防控措施，對防止傳染性疾病的院內傳播與暴發，具有重要意義。

近年來，隨著宏基因二代測序(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)技術在感染性疾病領域研究的不斷深入，基于mNGS的分子遺傳學檢測在感染性疾病中的診斷價值已逐漸被認識，mNGS已在多個領域被廣泛應用[1]，如多種疾病的早期診治、遺傳學和微生物檢測等。但mNGS在醫院感染防控中的作用報道較少，因此，認識mNGS在傳染性疾病的早期識別與診斷中的重要作用，對醫院感染防控早期干預意義重大。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性分析2018年1月1日至2019年12月31日復旦大學附屬中山醫院收治的5例傳染性疾病患者病例資料，包括一般資料、mNGS結果、常規微生物培養結果和醫院感染防控相關干預措施等。本研究通過復旦大學附屬中山醫院倫理委員會批準(No.B2017-193R)，所有患者均知情并簽署知情同意書。

納入標準：(1)患者住院期間行mNGS檢測；(2)mNGS結果為傳染性疾病，且其傳播可能會導致嚴重后果；(3)mNGS的標本質量合格，標本檢測過程中質控合格，結果可靠。排除標準：(1)患者住院期間未行mNGS；(2)mNGS結果為非傳染性疾病，或為傳染性疾病，但其傳播不會引起嚴重公共衛生事件；(3)mNGS過程中出現質控不合格。

1.3 mNGS (1)樣本處理與核酸提取：全血標本取3～4 mL，預先離心后取上清液；除血以外標本取0.5～3 mL。然后各類型標本中加入玻璃珠混合震蕩，采用TIANamp Micro DNA Kit(DP315,TIANGEN BIOTECH)試劑盒進行樣本DNA提取。(2)構建文庫：采用Agilent 2100 Bio-analyzer和定量PCR進行DNA文庫質控，文庫經環化形成單鏈環形結構后，滾環復制形成DNB納米球備用。(3)測序：將DNB納米球加載到測序芯片，采用BGISEQ-500(華大基因，中國)進行測序，根據測序結果剔除低質量數據后，比對微生物大數據庫(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/)，將測序結果按照病毒、細菌、真菌和寄生蟲等進行分類排列。

1.4 概念標準 (1)醫院感染：對患者出院后該病區患者、醫務人員及其他密切接觸者隨訪30 d，觀察是否出現新發相似感染癥狀人員，判斷是否發生院內傳播。(2)標準預防：針對所有病人的預防性措施，認定病人的血液、體液、分泌物、排泄物、損傷的皮膚、黏膜和被這些物質污染的物品具有潛在感染而采取的標準水平消毒、隔離等預防措施。無論患者是否確診或疑似感染，都要采取標準預防。

2 結 果

2.1 一般資料 結果(表1)顯示：5例患者納入本研究，均為男性，平均年齡為45.4歲。3例患者以發熱為主訴，1例以右上肢皮膚腫脹伴破潰流膿5 d為主訴，1例以左頸部搏動性包塊1月余為主訴。5例患者中，有蟲咬史1例，有瘧疾感染史2例。

表1 5例傳染性疾病患者一般資料分析

2.2 mNGS和常規培養結果比較 結果(表2)顯示：5例患者常規微生物培養均為陰性，mNGS結果：炭疽芽孢桿菌1例，霍亂弧菌1例，結核分枝桿菌復合群1例，三日瘧原蟲1例，惡性瘧原蟲1例。

2.2.1 患者A確診過程 2019年5月28日，送引流液行常規微生物培養，同時采集血標本送檢mNGS。5月30日mNGS結果為炭疽芽孢桿菌，5月30日回報微生物培養結果為陰性。追問病史：患者于2019年5月初有著短袖搬運死牛史，隨后出現右前臂傷口，結合mNGS結果及病史，初步確診炭疽。后續患者被轉至上海市公共衛生中心，期間通過PCR進一步確診炭疽。

表2 5例患者mNGS和常規培養結果比較

2.2.2 患者B確診過程 2019年8月21日采集傷口拭子標本送檢mNGS，8月23日結果為霍亂弧菌。8月28日送檢皮膚膿液及血行微生物培養，8月30日回報結果均為陰性。9月2號采集血標本送檢mNGS，9月4日結果依然顯示霍亂弧菌，檢出大量唯一匹配的霍亂弧菌序列數，檢出結果明確，且患者為慢性肝病患者，考慮非O1/O139霍亂弧菌引起的皮膚軟組織感染。

2.2.3 患者C確診過程 2019年11月15日行痰涂片找抗酸桿菌和痰分枝桿菌培養，11月17日回報結果均為陰性。2019年12月18日采集痰標本送檢mNGS，12月20日結果顯示：結核分枝桿菌復合群。12月20日結核菌感染T細胞斑點試驗(T-SPOT)結果示A/B：24/67。患者C入院時未考慮患傳染性疾病，住院過程中出現咳嗽、咳痰現象，但痰培養未見分枝桿菌，后根據mNGS結果及T-SPOT結果，確診結核。

2.2.4 患者D確診過程 2018年10月17日采集血標本送檢mNGS，10月19日結果顯示：三日瘧原蟲。10月20日回報血涂片鏡檢找瘧原蟲及進行寄生蟲全套抗體檢測結果，均為陰性。患者D有瘧疾感染史，檢出結果明確，同時結合患者此次生病期間發熱特點及流行病學史，確診瘧疾。

2.2.5 患者E確診過程 2019年1月7日行血涂片鏡檢找瘧原蟲，結果陰性，同時采集血標本送檢mNGS，1月9日結果顯示：惡性瘧原蟲。1月11日經中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所檢測后，結果為瘧疾快速診斷試劑卡顯示抗原陽性，涂片陰性。患者E有瘧疾感染史，mNGS檢出結果明確，結合其流行病學史，確診瘧疾。

2.3 醫院感染防控措施的調整 結果(表3)顯示：5例患者入院時醫院感染防控措施均為標準預防。根據mNGS結果，提早確診傳染性疾病并調整醫院感染防控措施，隨訪30 d內，未出現院內傳播新發病例。

表3 醫院感染防控措施的調整和病例隨訪情況

2.3.1 患者A的防控措施 及時將患者A轉入負壓單間病房進行隔離，相關醫護人員嚴格進行手衛生與口罩防護，對于需要進行密切接觸操作者，要求穿戴隔離衣及防護鞋，必要時佩戴護目鏡或面罩。患者所使用醫療設備進行嚴格消毒，加強環境清潔，患者出院后使用過氧化氫消毒機進行房間的終末消毒。對患者日常所更換被服及出院后的各種床單元用品統一裝入感染性織物袋中進行清潔消毒，規范處置該患者的醫療廢物。同時聯系我院防保科，進行病例上報，并請具有專業傳染病防控診治的上海市公共衛生中心專家會診，會診后轉至該中心進一步治療。經上述干預后，隨訪30 d內，未出現院內傳播的新發病例。

2.3.2 患者B的防控措施 霍亂通常由產霍亂毒素的O1/O139霍亂弧菌引起，在我國屬于甲類傳染病，但患者B未出現霍亂典型臨床表現——排“米泔樣”便。本患者為乙肝患者，血mNGS及皮膚傷口拭子均提示霍亂弧菌，培養結果均陰性，考慮非O1/O139霍亂弧菌可能性大，其傳播力較O1/O139霍亂弧菌弱，但仍需重視，因此對該患者加強接觸預防措施，相關接觸預防措施同患者A。同時聯系我院防保科，進行病例上報。對患者進行針對霍亂弧菌引起的皮膚軟組織感染治療后，患者病情好轉出院，且隨訪30 d內，未出現院內傳播的新發病例。

2.3.3 患者C的防控措施 及時將該患者轉移至單間隔離，醫務人員加強個人防護，佩戴醫用防護口罩，高危操作時佩戴N95口罩，嚴格執行手衛生，盡量避免家屬探視，加強通風。同時請上海市公共衛生中心專家進行會診，后續轉至該中心進一步治療。經上述干預后，隨訪30 d內，未出現院內傳播的新發病例。

2.3.4 患者D的防控措施 針對患者D，要特別注意防蚊滅蚊，避免蚊蟲帶來傳播，保持病區干凈衛生，注意通風。同時給予患者D正規抗瘧治療，患者好轉出院。經上述干預后，隨訪30 d內，未出現院內傳播的新發病例。

2.3.5 患者E的防控措施 請上海市公共衛生中心感染科會診進行進一步病例確認，調整后防控措施同患者D，同時給予患者E正規抗瘧治療，患者好轉出院。隨訪30 d內，未出現院內傳播的新發病例。

3 討 論

傳染性疾病是由各種病原體引起的，能在人與人、動物與動物或人與動物之間相互傳播的一類疾病。2020年1月20日，國家衛生健康委員會將新型冠狀病毒肺炎納入《中華人民共和國傳染病防治法》規定的乙類傳染病。中國目前的法定傳染病有甲、乙、丙3類，共40種。其中不乏傳播能力強、致病力強的疾病，故傳染病仍是一個十分重要的公共衛生問題[5]。如果不能對其進行早期識別，并給予針對性的防控措施，一旦發生院內傳播，將對醫院內患者造成巨大威脅，甚至形成影響嚴重的公共衛生事件。

在醫院的日常診療工作中，難免需要接觸許多處于潛伏期或傳染期的傳染性疾病患者，同時，醫院人流量大、交叉感染風險高，存在免疫力低下患者等眾多高危人群，傳播環節多且不易控制到位。并且許多醫院，特別是基層醫院普遍不重視傳染性疾病防控，一旦出現嚴重傳染性疾病暴發，后果不堪設想[6]。

目前傳染性疾病的診斷主要依賴常規微生物培養法[7]。國內絕大部分臨床微生物實驗室均采用基于生化反應的自動或半自動微生物鑒定系統進行菌種鑒定。MALDI-TOF MS技術可分離細菌和真菌[8]，但因儀器價格與技術等原因，目前尚未在基層醫院廣泛使用。但是，由于標本培養采集不規范、送檢時機不合理[9]及某些苛養菌常規方法難以培養等原因，常規微生物培養常呈現陰性結果，并且對一些少見、罕見及菌種復合體的鑒定，結果也不十分可靠[10-11]。而對病毒、寄生蟲的檢測，常規醫院更是難以開展[12]。因此，借助常規微生物培養結果鑒別診斷傳染性疾病時，感染控制部門常無法對疾病進行早期、準確地診斷，也就無法及時采取合適的防控措施，嚴重影響了傳染性疾病的防控工作。

mNGS檢測范圍覆蓋細菌、真菌、病毒、寄生蟲，可在病原體未知的情況下尋找病原體，比起傳統微生物培養法，監測范圍更廣、靈敏度更高[13]。目前mNGS在醫院感染方面的應用，大多只涉及醫療機構環境的污染檢測、利用全基因測序對醫院感染暴發進行追蹤及耐藥基因組研究等領域[14-16]，而對醫院感染防控中很重要的早期干預的應用還較少。mNGS在其他研究中體現出檢出率高、耗時短、精確性強等優勢[17-18]，如能應用到感染性疾病的早期診斷中，提早對患者進行針對性的干預措施，做好防護工作，保護高危人群，降低醫院傳播的風險，將會大大提升傳染性疾病的醫院感染防控工作效果。

本研究結果顯示，mNGS可有效發現未知傳染性病原體，快速鑒定疾病病原體，在最短時間內準確獲取病原體的全面信息，同時，還可幫助進行傳染性疾病的早期診斷，調整患者的治療方案，對有效控制傳染性疾病疫情也起到了決定性作用。并且，通過將mNGS的診斷標準進一步標準化、統一化，克服了診斷標準不明確、成本高的缺點[19-20]，使得mNGS在傳染性疾病早期診斷中應用更為明確。若將mNGS常規化，將來可為醫院感染防控工作做出更大貢獻。

綜上所述，mNGS在傳染性疾病的早期識別與診斷中具有重要作用，可對醫院感染防控早期干預起到良好的指導效果。