高通量測序分析酒糟魚中微生物群落多樣性

馬肖肖 趙利

1、江西科技師范大學生命科學學院

2、國家淡水魚加工技術研發分中心

草魚（Ctenopharyngodon idellus）是我國四大淡水家魚之一，其肉質肥嫩、味鮮美，深受消費者喜愛，是一種營養價值較高的水產品。酒糟魚是江西鄱陽湖地區的特色美食，產品選用活鮮草魚，以精釀酒糟糟制，通過糟制可使魚糟之間蛋白相互補進，魚肉的營養成分發生變化，經過微生物的作用鮮味氨基酸含量增加，各項指標均高于WHO/FAO 提出的參考蛋白模式標準[1]。有研究表明，微生物在酒糟魚糟制過程中發揮著極為重要的作用，影響著酒糟魚風味物質的變化和形成。將傳統分離方法與16S rRNA 分子鑒定技術相結合，對酒糟魚糟制過程中微生物進行分析得出酒糟魚的主要優勢菌為乳酸桿菌和明串珠菌，但由于傳統分離條件限制無法進行全面分析[2]。同時不同的糟制方式使酒糟魚產生了不同的風味物質，其微生物群落結構也將隨之發生變化。近年來，隨著技術的發展，高通量測序技術應運而生，其無須進行微生物分離培養，不僅可以檢出樣品中微生物的菌種組成，還能確定其相對豐度[3]。因此，高通量測序技術已廣泛應用于食品發酵、食品微生物檢測等多方面[4-5]。

為了全面地研究酒糟魚產品所含微生物種類情況，本實驗以實驗室自制酒糟魚和市場酒糟魚為研究對象，采用Illumina Miseq 高通量測序技術分析兩種不同酒糟魚樣品中的菌群組成情況及優勢菌種，分析其群落豐度和差異，為酒糟魚發酵過程中微生物的影響作用提供部分依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：酒糟魚（200～250 g）。工廠直取腌制魚塊標號為A，以A 做發酵處理自制酒糟魚標號為B，以A 做發酵處理工廠制作酒糟魚標號為C，三種魚均于同一時間段做處理。

試劑：實驗中用到的主要試劑和耗材如表1 所示。

表1 主要試劑/ 耗材

1.2 儀器設備

表2 主要儀器設備

1.3 方法

1.3.1 樣品的預處理

使用高溫滅菌的剪刀或刀片將樣品剪碎后混合均勻，取適量樣品（不超過0.5 g）放入2 ml 樣品管，在組織破碎儀中進行破碎后提取。

1.3.2 DNA 提取方法

按照Omega 公司細菌基因組DNA 提取試劑盒的方法操作，以OMEGA 試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit 提取試劑盒提取樣品總DNA，瓊脂糖凝膠檢測DNA 完整性，Qubit 定量檢測DNA 樣本濃度[6]。

1.3.3 PCR 擴增

利用Qubit3.0 DNA 檢測試劑盒對基因組DNA 精確定量，確定加入的DNA 量，以提取的總細菌基因組DNA 為模板，引物針對16S rRNA 基因V3/V4 區，利用341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）和805R（GACTACHVGGGTATCTAATCC）引物進行PCR 擴增。擴增后的PCR 產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，經純化后的樣品進行定量檢測[7]。將檢測后的樣品委托上海生工生物工程股份有限公司，進行高通量測序。

1.3.4 數據優化處理

Illumina MiseqtTM得到的原始圖像數據文件經CASAVA 堿基識別分析轉化為原始測序序列，由于Miseq 測序序列中含有barcode 序列，以及測序時加入的引物和接頭序列。首先需要去除引物接頭序列，再根據PE reads 之間的overlap 關系，將成對的reads 拼接（merge）成一條序列，然后按照barcode 標簽序列識別并區分樣品得到各樣本數據，最后對各樣本數據的質量進行質控過濾，得到各樣本有效數據[8]。

基于操作分類單元（OTU）聚類分析結果，選擇豐度最高的序列作為OTU 的代表性序列，進行各類的OTU 分析，通過Alpha 多樣性分析微生物群落的豐度和多樣性，繪制物種分類條形圖和物種豐度熱圖[19]。最后，基于物種分類結果，比較樣本菌種豐度存在顯著差異的物種分類，篩選條件為P≤0.05，綜合討論酒糟魚發酵產品中微生物群落的分布差異。

2 結果與分析

2.1 測序數據統計與OUT 分析

2.1.1 原始序列數據

圖1 為原始序列使用pear 融合后的序列長度及該長度reads數目；圖2 為質控（去除barcode、primer 以及部分低質量序列）后序列長度及該長度reads 數目。原始序列共163831 條有效序列，序列平均長度為453.40～465.52 bp，主要集中在461～480 bp 的區間長度內（圖1）。QC 后的序列共160522 條有效序列，平均長度為414.92～427.81，主要集中在425～435 bp 的區間長度內。

圖1 原始序列長度分布圖

圖2 質控后序列長度分布圖

2.1.2 OUT 分析

OTU 樣本分布韋恩圖如圖3 所示，不同顏色代表不同組，數字代表特異或共有的OTU 數。其中，B、C 兩組的OUT 數量高于A 組，即發酵后的酒糟魚產品樣品中的微生物種類在不斷增加；C 組OTU 數量高于B 組，說明市場酒糟魚產品微生物數目略高于實驗室自制酒糟魚產品。三種產品的共有OTU 數目為77 個，這部分微生物保留在了發酵末期，是對酒糟魚發酵益處較小的微生物；A、B 共有的66 個和A、C 共有的50 個OTU 數目則是由于酒糟魚發酵方式不同導致的改變；B、C 兩組發酵酒糟魚共有OTU 數目為73，這些微生物對酒糟魚發酵益處較大。

圖3 OTU 樣本分布韋恩圖

2.2 Alpha 多樣性分析

根據97%相似性水平下的OTU 信息，采用Alpha 多樣性指標的Shannon、Simpson、ACE、Chao1 及Coverage 指數對樣品微生物物種的豐富度和多樣性進行評估，結果如表3 所示。A 組樣品的ACE、Chao1、Shannon 指數均高于其他組，Simpson 指數均低于其他組，說明酒糟魚原樣群落分布豐度高于成品，證明了腌制后酒糟魚菌群分布豐度高于酒糟魚產品；但其菌群落分布多樣性較低，證明了糟制可以有效提高微生物多樣性如B 組的ACE、Chao1、Simpson 指數低于C 組，Shannon 指數大于C 組，說明實驗室自制酒糟魚菌群落分布豐度低于市場酒糟魚，群落多樣性大于市場酒糟魚，多樣性的菌種可以促進糟制過程中微生物作用的發揮。

表3 Alpha 多樣性分析表

圖4 所示的稀疏曲線圖中，以橫坐標為隨機取樣抽取到的序列數，縱軸為其所代表的OTU 數目構建的稀釋曲線反映了樣品的豐富度和測序合理性。以shannon 曲線為例，A、B、C 三條曲線均在序列數20000 左右時趨于平穩，足以證明測序數據量合理，更多的數據量只會加入少量的OTU 數目。圖5 所示的Rank-Abundance 曲線以OTU 等級為橫坐標，以每個OTU 中所含的序列數的相對百分含量為縱坐標做圖，反應了樣品的豐富程度和均勻程度。由圖可看出，A 組曲線較B、C 兩組平坦，說明腌制魚肉物種組成的均勻程度高于發酵酒糟魚兩組；而作為發酵酒糟魚的B、C 兩組物種組成均勻程度較為相似，貼近樣品總體。

圖4 Alpha 指數稀疏曲線圖

圖5 Rank_Abundance 曲線圖

2.3 不同酒糟魚細菌群落結構分析

2.3.1 基于屬水平的細菌菌群結構分析

三種酒糟魚樣本序列經分類分析，在屬水平上，其相對豐度排行前50 的菌群柱狀分布圖如圖6 所示，豐度較少統一作other，圖中橫軸為各樣品的編號，縱軸為相對豐度比例，在屬水平上，酒糟魚產品共分離得到了434 屬。

A 組腌制魚肉中魏斯氏菌屬（Weissella）所占的比例較大，余下依次為不動細菌屬（Acinetobacter） 和假單胞菌屬（Pseudomonas）。研究表明，肉制品中的魏斯氏菌能夠發酵葡萄糖、甘露糖、麥芽糖等產生D 乳酸或DL- 乳酸。B 組酒糟魚總細菌組成主要以乳酸桿菌屬（Lactobacillus） 為主，相對豐度37.03%，余下為布丘氏菌屬（Buttiauxella）、小球菌屬（Pediococcus）、弧菌屬（Vibrio）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、鹽水弧菌屬（Salinivibrio）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等。C 組酒糟魚總細菌組成同樣以乳酸桿菌屬為主，相對豐度50.81%，余下為魏斯氏菌屬（Weissella）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、 嗜 凍 菌 屬（Peptoniphilus）、 漫 游 球 菌 屬（Vagococcus）、葡萄球菌屬、鹽水弧菌屬、狹義梭菌屬（Clostridium sensu stricto）、 梭 菌 屬 （Fusobacterium）、 消 化 鏈 球 菌（Peptostreptococcus）、摩根氏菌屬（Morganella）和其他屬類。總體來看，發酵產生了更多菌種，且在豐度大于1%的菌種中，B 組少于C 組；在B、C 兩組中，乳酸桿菌屬可發酵葡萄糖并產生大量乳酸，是動物和人腸道等處重要的生理性菌群之一，同時也是常用的工業微生物菌種；小球菌屬中的乳酸小球菌（P.acidilactici）為同型發酵性乳酸細菌。

2.3.2 物種豐度熱圖

圖7 菌屬水平所有樣本物種豐度熱圖

將樣品以及菌群落分布信息進行聚類并重新排布，將聚類之后的結果顯示在heatmap 中，可以很好地反映各分類水平上群落分布組成的異同。圖7 所示的物種豐度熱圖為豐度最高的前50 個物種分類信息。由圖中可以看出，B、C 兩組在圖上方聚類樹中的位置靠近，說明兩組發酵酒糟魚中菌群分布最為類似。

在A 組腌制魚中，魏斯氏菌屬呈紅色，是主要組成部分，對比B、C 兩組顯示，魏斯氏菌屬和不動桿菌屬（Acinetobacter）呈黃色，說明發酵抑制了兩組菌屬；而在B、C 兩組發酵酒糟魚中，乳酸桿菌始終占據優勢，對比A 組藍色部分，Vagococcus、Vibrio、Staphylococcus、Salinivibrio、Enterococcus、Lactococcus 等菌屬呈現黃色及以上，說明其為發酵過程中的優勢菌屬。

此外還可以明顯看出在兩種酒糟魚樣品中，各有自己獨特的微生物菌群，如B 組的Pediococcus 和Bacillus，C 組的Peptoniphilus。

2.4 菌群豐度差異分析

為了得出B、C 兩組菌群豐度的差異，對B 組和C 組做差異分析。圖8 所示為兩種發酵酒糟魚中的豐度比例，中間所示為95%置信度區間內，物種分類豐度的差異比例，圖中p 值＜0.05，表示各菌群豐度均差異顯著。

圖8 B、C 兩組樣本差異比較誤差異圖

由圖8 可看出，在25 種分類中，B 組的差異性菌群有16種，Buttiauxella、Pediococcus、Vibrio、Bacilus 差異較大；C 組的差異 性 菌 群 有 9 種，Weisselllaa、Psychrobacter、Peptoniphilus、Vagococcus 差異較大。

3 結論與討論

本研究采用Illumina Miseq 高通量測序技術分析兩種不同酒糟魚樣品中菌群組成及變化情況。結果表明：發酵可以有效提高酒糟魚微生物群落分布多樣性，實驗室自制酒糟魚菌種豐度低于市場酒糟魚，菌種多樣性和菌群豐度差異項高于市場酒糟魚。兩種酒糟魚菌群結構存在差異，在屬水平上，實驗室自制酒糟魚樣品中微生物主要以乳酸桿菌屬、布丘氏菌屬，小球菌屬，弧菌屬假單胞菌屬等為主；而市場上酒糟魚樣品中微生物菌屬以乳酸桿菌屬、魏斯氏菌屬，嗜冷桿菌屬，嗜凍菌屬等為主。相對于傳統的分離鑒定方法，高通量測序技術在檢測優勢菌時更具優勢，兩種酒糟魚樣品都以乳酸桿菌為主要優勢菌種，其他優勢菌種包括漫游球菌屬、葡萄球菌屬等6 種，對酒糟魚發酵過程影響顯著。同時不同發酵方式導致了兩種酒糟魚各有其特殊菌種，實驗室自制酒糟魚以Buttiauxella、Pediococcus、Vibrio、Bacilus 等菌屬為主，市場酒糟魚以Weisselllaa、Psychrobacter、Peptoniphilus、Vagococcus 等菌屬為主。

高通量測序技術檢測不僅可以快速檢測微生物種類，對比不同發酵方式下酒糟魚的優勢菌和特殊菌，優化酒糟魚發酵工藝，還可以檢測酒糟魚發酵過程中微生物多樣性和豐富性，為酒糟魚成品的保藏提供一定的參考依據。