紅光對醬油發酵品質的影響

林上飛,劉木清，2

(1.復旦大學工程與應用技術研究院，上海 200433；2.復旦大學先進照明技術教育部工程研究中心，上海 200433)

引言

醬油是一種以大豆和面粉為原料，并借有米曲霉等單種或多菌種長時間發酵得到的調味品。在醬油發酵過程中，米曲霉因其不產生毒素以及其分泌的豐富酶系，使其一直作為發酵關鍵菌種被廣泛應用至今[1-4]。我國高鹽稀態發酵醬油具有利用太陽光進行曬制發酵的特點。由于太陽光譜波段覆蓋290～5 300 nm，對醬油發酵品質具有影響的光譜段和光照強度目前還沒確定。目前，已有部分研究者從基因和蛋白質組學層面研究光照對米曲霉生長發育等的調控作用。趙國忠等[5]對我國常用菌株米曲霉3.042首次進行測序，明確其與模式菌株RIB40具有相當的同源基因。說明對不同型號的米曲霉之間的研究結果具有一定參考價值。Hatakeyama等[6]發現紅光(610 nm)抑制米曲霉RIB40產孢子，但其后發現某工業生產用的菌株具有相反結果，說明紅光的作用依米曲霉菌株而定，是非保守的。此外，2015年，Murthy等[7]發現熒光燈也會抑制米曲霉F6的生長和孢子的形成，而這一特點適用于避免醬油發酵中過多米的曲霉生長。2012年李學偉等[8]利用濾色片分別得到具有紅外波段混雜的紅光、綠藍和藍光，并用于研究單色光對醬油發酵品質的影響，但其溫度沒有恒定，因而溫度作為主要影響手段對各理化指標的影響可能覆蓋了光質造成的次要影響。因此，本文從醬油發酵性能出發，設置630 nm峰值波長和光量子通量密度為2 033 μmolm-2s-1的紅光，探究其對米曲霉單菌種高鹽稀態醬油發酵的品質影響，為優化醬油發酵工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1)菌種和原料。米曲霉 (aspergillus oryzae)滬3.042:石家莊市鼎鑫釀造食品科學研究所。大豆、面粉、食鹽，均為市購。

2)主要儀器。立式高壓滅菌鍋：浙江新豐醫療器械有限公司；可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；醬油制曲一體機：泉州中翔生物技術有限公司；恒溫發酵罐：上海博賦玻璃儀器有限公司；低溫恒溫槽：江蘇天翎儀器有限公司；干燥箱：上海慧泰儀器制造有限公司；分析天平：上海天美天平儀器有限公司；量子傳感器：荷蘭Kipp&Zonen公司。

3)主要試劑。福林試劑：天津市光復精細化工研究所；無水碳酸鈉：北京博奧華醫生物科技有限公司；三氯乙酸：復旦大學危險化學品管理中心；磷酸鹽緩沖液：北京博奧華醫生物科技有限公司；干酪素：天津市光復精細化工研究所；L-酪氨酸：北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉：復旦大學危險化學品管理中心；硫酸：復旦大學危險化學品管理中心。所有試劑均為分析純。

1.2 方法

1)光照條件設置。在醬油的發酵過程中，往往需要避免米曲霉進一步消耗原料進行生長發育和產生孢子，使原料轉化率下降，因此選取紅光單色光LED芯片作為光源，峰值波長為630 nm，半峰寬為10 nm。而光照系統強度的設置則基于光合輻射PAR(photosynthetic active radiation)量子通量U與太陽輻射S估算關系式為[9]：

U=4.72ηPARS

(1)

其中，U為光量子通量密度(μmolm-2s-1)，ηPAR為太陽直接輻射中PAR能通量占全波段積分能通量S的比例。根據IEC891中太陽平均輻射強度1 000 W·m-2，以及7月份廣州比例值為0.430[9,10]，可算得7月份廣州平均光量子通量密度為2 030 μmolm-2s-1。

參考光譜組裝算法及光量子通量密度檢測方法[11-13]，實驗室自制光照試驗系統。對光照系統的光合光通量密度值進行調整，以最接近參考值，實測數據記錄于表1。對照組為黑暗組。在實驗期間，光照系統被固定于恒溫發酵罐正上方，光照時長為10 h/d，發酵周期為60 d。

表1 實驗組和對照組的參數設置Table 1 Setting of experimental group and control group

2)醬醪發酵的光照實驗。成曲制備工藝：大豆與水按1∶1.2質量比進行混合，潤水8 h，使大豆充分吸水至顆粒飽滿無皺，121 ℃高壓蒸15 min，并快速泄壓，使大豆蛋白分子適度變性。拌入大豆0.67倍(w/w)的面粉，待熟料冷卻至35～37 ℃時，接入0.03%(w/w)孢子，混合均勻。按照通風制曲法進行培養，溫度控制在30～35 ℃，培養至約第45 h，曲料至黃綠色后結束，獲得成曲。成曲的質量以中性蛋白酶活力來表征。

參考我國傳統高鹽稀態發酵工藝和日曬夜露法，將成熟曲料與18°Bé鹽水按1∶2.2(w/w)均勻混合，并發酵60 d。考慮到溫度對酶系的活性起最主要影響，為避免光照的熱量對醬醪產生明顯的熱效應，設置30 ℃恒溫發酵。發酵期間定期進行淋澆。分別于發酵第4 d、第20 d和第60 d抽取并過濾得到粗原油，進行全氮、氨基酸態氮和總酸的測定。

3)指標測定。中性蛋白酶活力的測定依據SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》。全氮的測定依據GB/T 18186—2000《釀造醬油》。氨基酸態氮含量的測定采用GB/T 5009.235—2016《食品中氨基酸態氮的測定》。總酸的測定按照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》。可溶性無鹽固形物含量的測定采用GB/T 18186—2000《釀造醬油》。

4)數據分析。所有檢測均重復三次，結果表示為平均值±標準偏差。使用GraphPad Prism8進行數據分析。采用F檢驗以判斷數據的方差齊性，采用T檢驗分析數據間的差異性。

2 紅光對醬油原油品質的影響

對醬油的成曲進行中性蛋白酶活力檢測，結果顯示中性蛋白酶平均活力為1606±98.0 U/g，表明米曲霉3.042菌株能正常分泌水解酶，該成曲可用于醬油的曬制發酵。將成曲等分并分別進行為期2個月的發酵，結果記錄于表2和圖1～圖3。我國醬油國家標準以全氮、氨基酸態氮和可溶性無鹽固形物三個指標對醬油品質進行等級劃分。下面分別就全氮、氨基酸態氮、可溶性無鹽固形物和總酸進行分析。

表2 第60天原油檢測結果Table 2 Results of soy sauce on day 60

1)全氮分析。全氮代表原油中含氮物質如可溶性蛋白、多肽和氨基酸等的總量。從圖1可以看出，全氮含量在前20 d發酵期間迅速提高，隨后增速稍緩。整個發酵期間，全氮總量一直在逐漸上升。在第60 d時，紅光組的全氮值比對照組高18%，并且兩者間具有極顯著差異。因此，在發酵60 d內，2 033 μmolm-2s-1強度的紅光可加速全氮的積累，可能對原料大分子蛋白的水解反應具有某種影響。此外，分別參照國標等級劃分標準，紅光組的全氮含量滿足特級指標(≥1.50 g/100 mL)，而對照組則處于一級指標(≥1.30 g/100 mL)。

圖1 全氮含量隨時間的變化Fig.1 Changes of total nitrogen content with time

2)氨基酸態氨和可溶性無鹽固形物的分析。氨基酸態氮為醬油原油中含氮的氨基酸量，一般標志著醬油的滋味。其含量越高，說明當前原料的水解反應越徹底，有更多的呈味氨基酸生成。從圖2可以看出，氨基酸態氮含量隨著發酵時間迅速增加，其中前20天的增速最大。第60 d時，紅光組的氨基酸態氮含量比對照組高出12%，具有統計學差異。與李學偉等[8]的做無光控溫發酵60 d得到的原油中的氨基酸態氮含量接近。因此，在發酵60 d內，2 033 μmolm-2s-1強度的紅光可加速全氮中的中間產物如可溶性蛋白和多肽等進行水解反應，產生氨基酸，使氨基酸態氮含量快速上升。此外，根據國標等級要求，第60 d時，紅光組和對照組的氨基酸態氮含量均滿足特級指標(>0.80 g/100 mL)。紅光組的可溶性無鹽固形物比對照組高14%，兩組間具有顯著性差異，且均滿足特級指標(>15.00 g/100 mL)。

圖2 氨基酸態氮含量隨時間的變化Fig.2 Changes of amino acid nitrogen content with time

綜合全氮、氨基酸態氮和可溶性無鹽固形物三個指標，紅光組均高于對照組，且滿足國標特級指標，而對照組滿足一級指標。因此，2 033 μmolm-2s-1強度的紅光曬制發酵得到的醬油品質更優。

3)總酸分析。除了豐富氨基酸呈現的滋味，以乳酸為主的有機酸類帶來的酸味也是醬油一種重要的呈味成分。醬油中的總酸，代表醬油中含有的乳酸、醋酸、檸檬酸和琥珀酸等各種有機酸的總量。由于醬油日曬夜露釀造工藝的開放式環境，醬醪不可避免會引入空氣中各種微生物，如乳酸菌、微球菌、酵母菌等。在醬醪發酵初期，特別是嗜鹽性片球菌這些耐鹽性的乳酸菌，其附著在醬醪表面生長繁殖，消耗雙糖生成單糖。隨后，單糖又進一步被消耗生成乳酸等有機酸，而有機酸的積累也使醬醪的pH逐漸下降。如圖3所示，兩組的總酸含量在第4 d時相近。隨著發酵時間，兩組的總酸含量差距逐漸增大，第60 d時，紅光組的總酸比對照組高28%，兩者具有極顯著差異。另一方面，兩組的pH均隨發酵時間而逐漸降低。第60 d時，紅光組的pH下降較快至4.73，與高鹽稀態醬油發酵呈弱酸性的過程一致[14]。因此，2 033 μmolm-2s-1強度的紅光相比黑暗條件更利于有機酸的積累，可明顯提高總酸含量。具體的原因還有待下一步對生成有機酸的相關細菌進行探究。

圖3 總酸隨時間的變化Fig.3 Changes of total acid content with time

3 結論

2 033 μmolm-2s-1強度的630 nm單色光對米曲霉單菌種高鹽稀態醬油光照60 d后，所得醬油原油的全氮、氨基酸態氮、可溶性無鹽固形物和總酸相比黑暗條件級別分別提升18%、12%、14%和28%，均具有統計學差異。其中，全氨和總酸的差異為極顯著。因此，采用2 033 μmolm-2s-1強度的630 nm單色光進行恒溫醬油發酵優于無光恒溫發酵，可促進原料如大豆蛋白分子的水解，促進可溶性蛋白、多肽和氨基酸等的積累，使醬油發酵性能得到提升，并具有縮短發酵周期的可能性。本文從醬油發酵性能的角度，初步探究一定強度的紅光對米曲霉單菌種高鹽稀態醬油發酵性能的影響，為優化醬油釀造工藝提供一些參考。

致謝：感謝佛山市海天(高明)調味食品有限公司童星等人對本研究的討論。