歸芪活血膠囊對頸椎病模型大鼠軟骨細胞的影響

程國良 姜艷玲 李冰冰

摘要 目的：研究歸芪活血膠囊對頸椎病模型大鼠軟骨細胞白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）及MKK3/6-p38MAPK信號通路的影響。方法：選取60只SD級大鼠作為研究對象，將其以隨機抽簽法等分成假手術組、模型組、歸芪活血膠囊組。其中模型組與歸芪活血膠囊組參考頸椎間盤退變模型，假手術組僅切開皮膚，隨后縫合。模型組不予以任何干預，歸芪活血膠囊組則予以歸芪活血膠囊灌胃治療。干預4周后，通過甲苯胺藍實施組織染色，以免疫組織化學法檢測軟骨細胞IL-6、IL-8含量，同時以Weatern Blot法檢測MKK3/6以及p38MAPK表達水平。結果：假手術組、歸芪活血膠囊組大鼠頸椎間盤軟骨細胞IL-6水平、IL-8水平均顯著低于模型組，差異均有統計學意義（P<0.05）。假手術組、歸芪活血膠囊組大鼠頸椎間盤軟骨細胞MKK3/6水平、p38MAPK水平相較于模型組明顯更低（均P<0.05）。經Pearson相關性分析可得：頸椎病模型大鼠軟骨組織IL-6、IL-8水平與MKK3/6、p38MAPK表達水平比較，差異均有統計學意義（均P<0.05）。結論：歸芪活血膠囊的應用可顯著降低頸椎病模型大鼠軟骨細胞IL-6、IL-8含量，同時可下調軟骨細胞MKK3/6以及p38MAPK蛋白表達水平，其主要機制可能是通過調節MKK3/6-p38MAPK信號通路，進一步下調IL-6、IL-8含量，從而達到治療頸椎病的目的。

關鍵詞 頸椎病;歸芪活血膠囊;白細胞介素-6;白細胞介素-8;MKK3/6-p38MAPK信號通路

Abstract Objective：To study the effects of Guiqi Huoxue Capsule on interleukin-6（IL-6），interleukin-8（IL-8）and mkk3/6-p38mapk signaling pathway in cervical spondylosis model rats.Methods：A total of 60 SD rats were selected as the research objects，and they were randomly divided into a sham operation group，a model group and a Guiqi huoxue Capsule group.The model group and the Guiqi Huoxue Capsule group referred to the cervical disc degeneration model，while the sham operation group only cut the skin and sutured it afterwards.The model group was not given any intervention，while the Guiqi huoxue Capsule group was given gavage to the treatment group.After 4 weeks of intervention，tissues were stained with toluidine blue，and IL-6 and IL-8 contents in chondrocytes were detected by immunohistochemistry，and mkk3/6 and p38MAPK expression levels were detected by Weatern Blot.Results：The IL-6 levels of cervical intervertebral disc chondrocytes in the sham operation group and the Guiqi Huoxue Capsule group were which were significantly lower than those in the model group，with significant differences（P<0.05）.The levels of MKK3/6 and p38MAPK of chondrocytes in cervical intervertebral discs of rats in the sham operation group and Guiqi Huoxue Capsule group were significantly lower than those in the model group（both P<0.05）.Pearson correlation analysis showed that the levels of IL-6 and IL-8 in cartilage tissue of cervical spondylosis model rats were significantly different from the expression levels of MKK3/6 and p38MAPK（all P<0.05）.Conclusion：The application of Guiqi Huoxue Capsule can significantly reduce the contents of IL-6 and IL-8 in chondrocytes of cervical spondylosis model rats，and down-regulate the expression levels of MKK3/6 and p38MAPK protein in chondrocytes.The main mechanism may be to further down-regulate the contents of IL-6 and IL-8 by regulating the MKK3/6-p38mapk signaling pathway，so as to achieve the purpose of treating cervical spondylosis.

Keywords Cervical spondylosis; Guiqi huoxue Capsule; Interleukin-6; Interleukin-8; Mkk3/6-p38MAPK signaling pathway

中圖分類號：R681.5 文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.16.003

隨著人們生活方式以及工作形式的不斷改變，頸椎病的發病率正呈逐年升高趨勢，椎間盤退變是頸椎病主要的病理基礎，且會累及周圍軟組織、脊髓神經根以及血管[1]。有相關研究報道顯示，炎性細胞因子參與了椎間盤退變過程，其主要機制可能與軟骨終板破壞有關[2]。另有相關研究報道表明，在椎間盤退變后，對患者眾多炎性細胞因子水平進行檢測發現[3]，白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）分泌呈增多現象。因此積極減少炎性反應細胞因子的產生，早期對軟骨細胞的炎性反應進行有效抑制，延緩炎性細胞因子導致的軟骨終板退變，對椎間盤突變的防治具有極其重要的意義，應予以重視。目前臨床上治療頸椎病包括手術治療以及保守治療，前者本身存在一定的風險性，且術后易出現一系列并發癥，不利于推廣普及。后者相較于前者而言，更易被患者所接納，尤其是中草藥治療具有不良反應少、經濟成本低、舒適性較高以及操作簡便等優勢[4]。鑒于此，本文通過研究歸芪活血膠囊導致頸椎病模型大鼠軟骨細胞IL-6、IL-8及MKK3/6-p38MAPK信號通路的變化，旨在為歸芪活血膠囊應用于頸椎病的治療中提供理論依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取60只SD級大鼠作為研究對象，大鼠均購自南京青龍山動物實驗中心，均為清潔級，體質量為230～270 g，均實施單籠飼養，自由飲水，控制室溫在24 ℃左右。

1.1.2 藥物 歸芪活血膠囊（魯南厚普制藥有限公司，國藥準字Z20090686），藥物主要成分：黃芪、當歸、白芍、制何首烏、枸杞子、槲寄生、鹿茸、骨碎補、威靈仙、透骨草、人工麝香、葛根、川芎等。

1.1.3 試劑與儀器光學顯微鏡（上海普赫光電公司，Pooher型）;RM2235切片機（萊卡公司，德國，型號：RM2235型）;石蠟包埋機（亞光醫用公司，型號：YB-9LF）;FlexiFprce ELF System（Tekscan公司，美國，型號：FlexiFprce ELF）;超低溫冰箱（SANYO公司，日本，型號：MDF-C8V）;低溫高速離心機（Beckman公司，美國，型號：Microfuge22R）;Images Advanced 6.0醫學圖像采集系統（麥克奧迪公司，加拿大，型號：Motic Med6.0）;10%水合氯醛、無水乙醇、枸櫞酸緩沖液、蘇木精染液、冰醋酸、甲苯胺藍、麗春紅染色液（Bellman.TECH公司，美國，貨號：150245、163473、119248、102433、141681、162059、138230）;磷酸鹽緩沖液（Hyclone公司，美國，貨號：018023）;PVDF膜（Millipore公司，美國，貨號：019004）;IL-6、IL-8免疫組化SP試劑盒（BIO-RAD公司，美國，批號：018244、018631）;免疫印跡一抗（CST公司，美國，貨號：019102）;BCA蛋白定量盒、RIPA裂解液、二抗、TBS以及SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（Beyotim TECH公司，美國，貨號：020144、017348、019409、020102、018317）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將上述60只SD級大鼠以隨機抽簽法分成假手術組、模型組、歸芪活血膠囊組，每組20只。首先對大鼠進行稱重，嚴格按照體質量予以腹腔注射麻醉藥，確保大鼠充分麻醉。將麻醉后的大鼠固定于固定板上，要求大鼠的腹部和固定板緊貼，四肢粉筆固定在兩側，背部朝上。對其頸后部位的毛發進行剪除處理，通過碘伏消毒后，以手術刀在大鼠頸背部后正中線位置縱向切開皮膚，切口長度2.5 cm。假手術組大鼠手術切開后即常規止血縫合。模型組和歸芪活血膠囊組借助血管鉗等器材，逐層鈍性分離肌肉，切斷頸部淺層與深層肌肉組織。術后予以常規止血、縫合處理，觀察組大鼠情況，并繼續飼養3個月。

1.2.2 給藥方法 假手術組大鼠每日定點予以固定處理，但不予以其他手段干預。模型組大鼠造模成功后不予以任何干預。歸芪活血膠囊組大鼠在造模成功后實施歸芪活血膠囊灌胃干預，使用劑量為1粒/次，3次/d，連續干預4周。

1.2.3 標本采集 分別稱重大鼠，予以致死量腹腔麻醉，確定大鼠麻醉到位后，于低溫條件下進行相關實驗操作。保留大鼠樞椎，實施枕骨后的斷頭處理。用手術刀順著大鼠頸后部正中線縱向切開皮膚，鈍性分離各層肌肉和軟組織，取下C2～7頸椎骨，手術過程中務必保證椎間盤以及軟骨完整性。采用PBS液體清洗干凈取下的組織，用4%多聚甲醛將部分椎間盤組織固定1～2 d，用于免疫組化檢測。剩下的組織用液氮保溫瓶冷凍，并盡快置于-80 ℃冰箱保存，用于Western Blot檢測。

1.3 檢測指標和方法

1.3.1 采用免疫組織化學法檢測檢測IL-6、IL-8的含量 具體方法：對石蠟標本進行切片、脫蠟、水化處理，以超純水反復沖洗，并以PBS液重復沖洗3次，3 min/次。予以抗原修復、染色以及觀察。

1.3.2 采用Western Blot檢測MKK3/6、p38MAPK表達水平 具體方法：首先將組織用液氮冷凍，然后稱重并迅速放入勻漿器皿內，加入定量的液氮研磨組織至粉末為止。滴加60 μL/mg預冷含PMSF的蛋白裂解液，確保椎間盤組織充分裂解。重復碾磨組織，反復數次，間隔2 min/次。然后將研磨組織放置于冰上裂解30 min，在蛋白被充分裂解后，將裂解完成的組織置入做好標記的離心管內于4 ℃溫度下離心，離心條件為1 200 r/min，時長5 min，取上清液，分裝于EP管內，保存在-80 ℃冰箱中。取96孔板分別加入相應試劑，振蕩30 s后，放置在37 ℃恒溫箱中孵育0.5 h，進行比色測定。然后進行SDS-PAGE電泳、轉模處理，并依次加入一抗、二抗，顯影后進行圖像分析。通過成像分析儀進行測定，并以目標帶與Graph條帶灰度值的比值表示蛋白相對表達量。

1.4 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件對研究數據進行統計分析，計量數據以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗;計數資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗。頸椎病模型大鼠軟骨組織IL-6、IL-8水平與MKK3/6、p38MAPK表達水平的關系采用Pearson相關性分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 3組大鼠頸椎間盤軟骨細胞IL-6、IL-8水平比較 假手術組、歸芪活血膠囊組大鼠頸椎間盤軟骨細胞IL-6及IL-8水平均顯著低于模型組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1。

3.2 3組大鼠頸椎間盤軟骨細胞MKK3/6以及p38MAPK表達水平比較 假手術組、歸芪活血膠囊組大鼠頸椎間盤軟骨細胞MKK3/6及p38MAPK水平相較于模型組均明顯更低，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2。

3.3 頸椎病模型大鼠軟骨組織IL-6、IL-8水平與MKK3/6、p38MAPK表達水平的相關性分析 經Pearson相關性分析，頸椎病模型大鼠軟骨組織IL-6、IL-8水平與MKK3/6、p38MAPK表達水平均呈正相關，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

4 討論

中醫學認為，頸椎病當屬“眩暈”“痹癥”范疇，其主要發病機制為肝腎內窺，其標為風、寒、濕痹著，病位于筋骨[5-7]。中醫對頸椎病癥候診斷標準囊括下述4個類型：氣滯血瘀證：受外傷或（和）損傷導致頸椎病證，其表現為痛點固定，多見夜間加重，伴有肢體麻木，舌紫暗，脈澀等。風寒阻絡證：由風寒濕邪導致的頸椎病證，表現為頸項疼痛、活動不利、肢端麻木舌淡苔薄脈沉遲等癥狀。肝陽上亢證：表現為頸部疼痛麻木不適，伴頭痛目赤，急躁易怒，便秘，舌紅苔黃，脈弦等癥狀[8-10]。氣血不足證：由氣血不足導致的病證，表現為脹痛沉重，伴眩暈膝軟，無力疲憊，舌淡苔白脈無力等。歸芪活血膠囊具有益氣補腎、活血通路的作用，可治療因身體虛弱、煩勞、經常伏案工作以及外傷、先天畸形等因素導致的頸椎病[11-13]，然而關于其具體作用機制尚且進一步從細胞、分子生物水平上進行研究。

IL-6和椎間盤基質降解酶存在密切相關，IL-6可能正是通過酶的活性被抑制途徑發揮的致炎作用，其中IL-6可影響其他致炎物質的釋放，且在局部炎性反應過程中，IL-6可增強局部反應[14-15]，因此IL-6可能會促進椎間盤退變的進程。IL-8作為炎性反應促進因子之一，其可在炎性反應細胞聚集過程發揮進行性刺激作用，同時可激活以及促進炎性反應遞質的釋放，進一步加速了椎間盤中的炎性反應，促進了病情進展[16-17]。本文結果發現，假手術組、歸芪活血膠囊組大鼠頸椎間盤軟骨細胞IL-6、IL-8水平均顯著低于模型組（均P<0.05）。這在杜偉等人的研究中得到證實[18]：IL-6具有促炎以及抗炎的雙作用，可在一定程度上影響椎間盤退變，且表達水平和椎間盤退變呈正相關趨勢。同時董振風等人采用放免法測量IL-8以及TNF的作用機制發現[19]：在椎間盤退變中，于突變早期階段上述2種炎性因子的含量較低，而隨著突出程度的加劇，其含量顯著增加。分析原因，筆者認為IL-6可通過刺激炎性反應細胞的聚集，促進炎性反應遞質合成，進一步介導了椎間盤退變的過程。而IL-8可大量合成MMP-3，繼而引起巨噬細胞大量的聚集，加速了椎間盤退變的吸收過程，并加重了椎間盤退變的炎性反應。因此作者推測，歸芪活血膠囊治療頸椎病的可能機制在于下調IL-6與IL-8的表達。此外在椎間盤退變過程中，突變程度的加劇和磷酸化情況均與p38MAPK信號通路存在密切相關，激活的p38MAPK信號通路會促進炎性細胞因子的大量聚集，進一步通過促進細胞外MMPs釋放等途徑，促進了椎間盤退變進程[16]。另外p38MAPK的級聯反應分別為MKK3/6、P38MAPK、PAK、MLK，其中PAK、MLK的磷酸化會促進MKK3/6的表達，進一步誘導p38MAPK基因轉錄。而本文結果發現，假手術組、歸芪活血膠囊組大鼠頸椎間盤軟骨細胞MKK3/6、p38MAPK水平相較于模型組明顯更低（均P<0.05）。這提示了歸芪活血膠囊用于頸椎病大鼠治療中的可能機制為影響MKK3/6-p38MAPK信號通路。

綜上所述，歸芪活血膠囊的應用可抑制MKK3/6-p38MAPK信號通路，繼而抑制IL-6、IL-8的表達，最終達到防治椎間盤退變的目的。

參考文獻

[1]Noguchi N，Lee B，Kondo K，et al.Changes in reaching skill in patients with cervical spondylosis after cervical decompression surgery[J].J Phys Ther Sci，2019，31（10）：760-764.

[2]范迪慧，沈來華，邊曉東，等.施氏溫針對神經根型頸椎病炎癥狀況內皮素丙二醛水平的影響及其機制分析[J].中國藥物與臨床，2019，19（5）：702-705.

[3]胡煒，馬信龍，袁建軍，等.臨床癥狀不同頸椎病患者頸椎間盤白細胞介素1β及白細胞介素6和環氧化酶2的表達[J].中國組織工程研究，2016，20（35）：5270-5276.

[4]段小素，屈濤.蠲痹湯加減聯合神經阻滯治療神經根型頸椎病的療效觀察[J].中藥材，2019，42（1）：219-221.

[5]李婷，莊禮興.莊禮興教授頸肩穴結合桂枝湯治療頸椎病經驗總結[J].浙江中醫藥大學學報，2019，43（7）：702-705.

[6]丁曉燕，陳建秋，劉薛峰，等.中藥口服聯合穴位注射治療神經根型頸椎病臨床研究[J].中國中醫藥信息雜志，2019，26（9）：38-42.

[7]陸雅君，方婭貝，徐忠敏，等.益氣化瘀補腎方聯合“整頸三步九法”治療神經根型頸椎病60例療效觀察[J].中國中醫藥科技，2019，26（3）：404-405.

[8]Reddy RS，Tedla JS，Dixit S，et al.Cervical proprioception and its relationship with neck pain intensity in subjects with cervical spondylosis[J].BMC Musculoskelet Disord，2019，20（1）：447-448.

[9]Cawley DT，Alzakri A，Fujishiro T，et al.Carbon-fibre cage reconstruction in anterior cervical corpectomy for multilevel cervical spondylosis：mid-term outcomes[J].J Spine Surg，2019，5（2）：251-258.

[10]Malige A，Morton PN，Carolan GF，et al.The operative treatment of shoulder pain in patients with a concurrent diagnosis of cervical spondylosis and shoulder dysfunction[J].J Spine Surg，2019，5（2）：207-214.

[11]周巖.氟桂利嗪結合歸芪活血膠囊治療頸椎病的臨床實驗研究[J].內蒙古中醫藥，2014，33（28）：65-66.

[12]李冠彥，張盛強，朱干，等.活血通絡湯聯合臥位平衡手法治療椎動脈型頸椎病的療效及對動脈血流速度的影響[J].現代生物醫學進展，2018，18（16）：3106-3110.

[13]孫成磊，王磊升，劉培盛，等.歸芪活血膠囊對脊柱外科手術后血虛發熱的臨床療效觀察[J].中國老年保健醫學，2019，17（4）：83-86.

[14]王慶華，馮娟，李玉娥，等.綜合應用捷可通治療頸性眩暈的療效觀察[J].中國醫藥，2006，1（2）：92-93.

[15]郭倩，杜朝暉，郭偉，等.頸七針治療神經根型頸椎病臨床研究[J].中國中醫藥信息雜志，2019，26（3）：25-28.

[16]董良杰，王勤儉，王單一，等.仙鹿芪葛湯聯合調督針刺療法對頸椎間盤突出癥患者癥狀及血清p-P38MAPK水平的影響[J].中草藥，2019，50（9）：2139-2145.

[17]楊璐，劉同生，吳大斌.丹參酮ⅡA磺酸鈉聯合前列地爾對椎動脈型頸椎病血液流變學及血清炎性因子的影響[J].川北醫學院學報，2017，32（2）：236-238.

[18]杜偉，申勇，李寶俊，等.細胞因子IL-1a、IL-6、TNF-a、MMP3與頸椎間盤退變機制的相關性研究[J].中國矯形外科雜志，2012，20（3）：259-262.

[19]董振風，黃秀芳，董永東，等.IL-8及TNF在突出椎間盤中的表達意義[J].濰坊醫學院學報，2008，30（5）：447-448.

（2020-05-15收稿 責任編輯：王楊）