丁苯酞對阿爾茨海默病模型大鼠海馬CA1 區Wnt3a及β-連環蛋白表達的影響

鄧春穎，李海濱，毛文靜，李世英，劉斌

作者單位：1華北理工大學附屬醫院神經內科，河北 唐山063000；2遵化市人民醫院心內科，河北 遵化064200

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）目前被認為是導致老年癡呆的主要原因，其發病率不斷上升，不僅嚴重影響病人的生活質量，對社會經濟亦造成不良影響。目前關于該病發病機制尚不明確［1］，亦沒有特效治療方法及藥物。丁苯酞（dl-3-nbutylphthalidle）是從芹菜籽中提取出來的小分子物質，是我國自主研發的治療缺血性腦血管病的新藥。丁苯酞通過拮抗炎癥反應、抑制神經元凋亡等起到保護腦細胞作用［2］。而體內細胞增殖、分化、凋亡等多種程序受Wnt 信號通路控制［3］。研究表明，異常磷酸化的β-連環蛋白（β-catenin）在Wnt信號通路未啟動時明顯升高，導致β淀粉樣蛋白（Aβ）對腦神經元毒性作用加大，而Aβ 大量沉積即可誘發AD［4-5］。Wnt 通路發揮抗凋亡作用的主要效應因子是 β-catenin［6］。而 Wnt3a 是 Wnt 信號通路的啟動因子，觀察其濃度變化，可了解Wnt 信號通路激活情況。本研究于2017 年12 月至2018 年12 月通過觀察丁苯酞對Wnt3a 和β-catenin 蛋白表達的影響，為AD治療尋找一個新靶點。

1 材料與方法

1.1實驗動物2～3 月齡健康清潔級雄性SD 大鼠72 只，體質量范圍為250～280 g，實驗動物購于北京華阜康生物科技有限公司提供，生產許可證號SCXK［京］2014-0010。將實驗動物自由進食喂養于華北理工大學屏障環境動物實驗室，室溫控制在24～26 ℃，相對濕度45%～55%，12 h 明暗交替光照，實驗前適應喂養1周

1.2藥物與試劑丁苯酞軟膠囊（購于石藥集團恩必普藥業有限公司，國藥準字H20050299，批號121101，規格0.1 克/粒）；兔抗大鼠Wnt3a 多克隆抗體、兔抗大鼠β-catenin 多克隆抗體（均購于北京博奧森生物公司）；兔二步法免疫組織化學試劑盒、DAB顯色液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）低分子質量標準蛋白（均購于北京中杉生物有限公司）。

1.3主要儀器德國LEICA 公司的石蠟組織切片機；日本HITACHI 公司的透射電子鏡；安徽淮北正華生物儀器設備有限公司的腦立體定位儀；淮北正華生物儀器設備有限公司的Morris 水迷宮；張家港市航天醫療電器有限公司的電凝儀。

1.4方法

1.4.1 動物分組 采用隨機數字表法將實驗大鼠分為假手術組（Sham 組）、AD 模型組（AD 組）、丁苯酞治療組（丁苯酞組），造模成功后，在各組內采用隨機數字表法分為造模后1、2、4和8周4個亞組。

1.4.2 模型制備 提前制備濃度為1 μg/μL的β-淀粉樣蛋白1-42（beta-amyloid people 1-42，Aβ1-42）溶液，并制成凝聚狀態。采用Morris水迷宮篩選大鼠，保留合格實驗動物。采用腹腔注射方式麻醉大鼠（10%水合氯醛，350 mg/kg），麻醉后將大鼠固定于腦立體定位儀上，選擇雙側海馬CA1 區為注射區，以前囟為基準點，向后4.5 mm，中線旁開2 mm 處，開顱，暴露大鼠硬腦膜，將微量注射器與腦表面垂直，緩慢進針，深度2 mm，AD 組及丁苯酞組均緩慢注入5 μL 提前制備好的Aβ 溶液，留針10 min 后撤出針頭，用骨蠟封閉骨質創口，縫合并消毒切口。Sham組注射5 μL 0.9%氯化鈉溶液。

1.4.3 給藥方法 造模4周時進行Morris 水迷宮實驗檢測各組大鼠學習記憶能力，造模前后比較差異有統計學意義視為模型成功。丁苯酞組給予丁苯酞混合溶液（丁苯酞與食用油混合，濃度8 mg/mL，劑量1 mL/100 g）進行灌胃，每日2次；Sham組、AD組給予同等劑量的食用油灌胃，每日2次，連續給藥1、2、4、8周。

1.4.4 免疫組織化學檢測 將大鼠喂養至各個時相點，腹腔注射麻醉（10%水合氯醛，350 mg/kg）大鼠，麻醉后暴露心臟，由心尖插入灌注針并固定至升主動脈處，剪開右心耳快速灌注0.9%氯化鈉溶液，沖洗血管內血漬，至肝臟變白后，用4%多聚甲醛滴注至大鼠僵硬后，斷頭取腦，分離腦組織，腦組織浸泡于4%多聚甲醛-磷酸緩沖鹽溶液（PBS）固定過夜，次日用石蠟包埋含海馬的腦組織，制備切片備用。取已經制備好的腦組織切片標本，加封閉液后分別滴加一抗，抗Wnt3a 抗體（1∶400）、抗β-catenin 蛋白（1∶300），4 ℃過夜，滴加二抗孵育后進行DAB 顯色。參照試劑說明書進行操作。免疫組織化學陽性標準為鏡下可見細胞質、細胞核呈棕褐色。采集操作后的組織切片圖像（OLYMPUS攝像顯微鏡，400×），采用隨機數字表法觀察不重疊的各組大鼠海馬CA1 區6 個視野，導入Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統進行分析。

1.4.5 蛋白質印跡法檢測 大鼠喂養至各個時相點后，采用腹腔注射麻醉（10%水合氯醛，350 mg/kg）大鼠，于冰臺上直接斷頭，迅速取出腦組織，用冷的PBS 漂洗后，分離出海馬組織。將取出的組織放入15 mL離心管中，加組織裂解液，充分研磨后于漿器中裂解40 min，裂解后離心取上清液，儲存于-80 ℃超低溫冰箱備用。實驗前定量分裝蛋白，將其濃度調至800 μg/mL，加等體積上樣緩沖液后沸水中煮5 min。冷卻至室溫，放入4 ℃冰箱備用。實驗檢測步驟：分別取各組蛋白樣品（50 μg），置于10% SDS-PAGE，以濕轉法電轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，室溫封閉2 h。分別加入一抗，抗Wnt3a抗體（1∶500）、抗β-catenin蛋白（1∶500），置于4 ℃冰箱孵育過夜，次日漂洗后加入羊抗兔二抗（1∶2 000），置于37 ℃反應2 h，PBS洗膜3次加5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽/四唑淡藍（BCIP/NBT）顯色數分鐘，雙蒸餾水終止顯色，Image J軟件進行灰度值分析。

1.5統計學方法應用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。結果以xˉ±s表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組大鼠海馬CA1區Wnt3a、β-catenin免疫組織化學檢測結果在Sham組中，Wnt3a、β-catenin蛋白在實驗大鼠各時間點海馬CA1區可有少量表達。在AD 組中，實驗大鼠各時間點表達增多，1 周時表達量增多，2周時表達繼續增多，4周時最高，8周時稍有下降但仍有較多表達。與Sham組相比，Wnt3a蛋白在AD 組實驗大鼠各時間點表達均增多（P＜0.05）；β-catenin蛋白在AD組大鼠各時間點表達差異無統計學意義（P＞0.05）；與AD 組比較，Wnt3a、βcatenin 蛋白在丁苯酞組實驗大鼠各時間點表達均明顯增加（P＜0.01）。見表1，2 和圖1，2。

表1 各組大鼠海馬CA1區Wnt3a免疫組織化學檢測結果比較/（個/高倍視野，）

表1 各組大鼠海馬CA1區Wnt3a免疫組織化學檢測結果比較/（個/高倍視野，）

注：與Sham 組比較，aP＜0.01；與阿爾茨海默?。ˋD）組比較，bP＜0.01

images/BZ_14_1285_464_2240_514.png11.67±1.25 14.83±1.46a 17.17±1.77b 16.73＜0.01 Sham 組AD 組丁苯酞組F 值P 值666 8.17±1.34 10.50±0.96a 12.33±1.25b 15.29＜0.01 8.83±1.86 12.17±1.86a 15.17±1.21b 17.89＜0.01 10.17±1.07 16.67±0.94a 19.33±1.60b 72.56＜0.01

表2 各組大鼠海馬CA1 區β-連環蛋白（β-catenin）免疫組織化學檢測結果比較/（個/高倍視野，xˉ±s）

2.2各組大鼠海馬CA1區Wnt3a、β-catenin蛋白質印跡法檢測結果各組大鼠海馬CA1 區Wnt3a、β-catenin 蛋白質印跡法檢測結果同免疫組織化學檢測結果，見表3，4和圖3。

3 討論

AD 是老年性癡呆中的代表疾病，其發生發展緩慢，且與年齡相關。AD 主要臨床表現是記憶力減退、進行性認知功能障礙、理解力及判斷力衰退等，甚至出現精神行為異常。老年斑形成是AD 的主要病理改變，其主要成分為Aβ 聚集、Tau 蛋白相關的神經元纖維纏結（NFTs）、神經元減少等。Aβ學說認為AD 病人腦中堆積的過量Aβ，會對神經元產生毒性作用，并能引起腦部炎癥及細胞凋亡［7］。發現AD發病機制，并對其進行干預，可能達到改善病情的作用。Wnt/β-catenin信號通路被公認為與中樞神經系統發生、發展關系密切。Wnt/β-catenin 信號通路對神經干細胞的增殖、分化、對神經元軸突生長及突觸發育起調節作用，亦參與凋亡等過程，對中樞神經系統變性起到保護作用［8-10］。Wnt3a 是Wnt 信號通路啟動因子，其表達量增加能促進細胞分裂、分化、增殖［11］。Wnt3a對海馬的增殖及分化也很重要，敲除Wnt3a基因的小鼠，海馬前體細胞增殖受限，致海馬功能受損［12］。β-catenin是位于Wnt信號通路下游中的關鍵因子，主要位于細胞膜，少量游離于細胞質中，抑制β-catenin磷酸化，胞質中其含量增加，對細胞核內靶基因表達起調節作用［13］，參與細胞生長、發育、分化和凋亡等過程。多項研究發現Wnt3a、β-catenin在AD發病過程中減少，表明此機制參與發病過程。本實驗免疫組織化學和蛋白質印跡法結果顯示，AD 模型組各時間點大鼠海馬CA1 區Wnt3a、β-catenin蛋白表達增多，1周時表達增多，2周時表達繼續增多，4周時表達量最高，8周時稍有下降但仍處于較高水平，說明Wnt/β-catenin 信號通路在AD的演變過程中起著重要作用。

表3 各組大鼠海馬CA1區Wnt3a相對表達量蛋白質印跡法結果比較/xˉ±s

表4 各組大鼠海馬CA1區β-連環蛋白（β-catenin）相對表達量蛋白質印跡法結果比較/xˉ±s

丁苯酞是我國自主研發的新藥，廣泛應用于臨床，用于治療缺血性腦血管。而丁苯酞除了具有改善循環、抗自由基等作用外，還具有抗氧化、抑制炎癥、抗凋亡等作用［14-16］。丁苯酞在應用于急性缺血性腦卒中研究中發現丁苯酞能夠改善病人認知功能［17-19］。王偉等［20］研究發現丁苯酞對海馬神經元的保護作用可能是通過降低5-羥色胺的表達來實現的。但國內外關于通過干預Wnt/β-catenin 從而達到腦保護作用的研究較少。本研究免疫組織化學和蛋白質印跡法檢測結果均表明，丁苯酞治療組大鼠海馬CA1 區Wnt3a 和β-catenin 蛋白表達明顯增加，說明丁苯酞可通過上調Wnt/β-catenin 途徑中啟動因子Wnt3a 和下游因子β-catenin 的表達，發揮對AD 的腦保護作用，在給藥4 周時作用達到高峰，這為AD的治療提供了新的思路。

綜上，丁苯酞通過上調Wnt3a 及β-catenin 的表達，發揮對AD的治療作用，其與用藥時間有關。本研究為AD的治療提供新線索。

（本文圖1～3見插圖9-1）

圖1 各組大鼠海馬CA1區Wnt3a免疫組織化學檢測結果（免疫組織化學染色×400） 圖2 各組大鼠海馬CA1區β-連環蛋白（β-catenin）免疫組織化學結果（免疫組織化學染色×400） 圖3 各組不同時間點大鼠海馬CA1區Wnt3a、β-連環蛋白（β-catenin）蛋白電泳圖（蛋白質印跡法）