迷迭香酸聯合槲皮素對人肝癌HepG2細胞增殖和遷移的影響

劉慶東，白跳艷，王曄飛，姚楊

作者單位：1榆林市第一醫院，a消化內科，b肝膽外科，陜西 榆林719000；2西安醫學院第一附屬醫院，a檢驗科，b中心實驗室，陜西 西安710077

原發性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，發病率和病死率較高［1-3］。盡管肝癌的治療方法不斷進步，但仍然存在預后效果差、術后轉移或復發率高、對放化療不敏感等局限性［4-6］。因此迫切需要尋找安全有效的治療策略。槲皮素（quercetin）是一種天然的黃酮類化合物，能夠抑制多種腫瘤細胞的增殖、轉移的作用［7-8］。迷迭香酸（rosmarinic acid）是一種廣泛分布的水溶性酚酸類化合物［9-10］。且具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用［11-13］。其抗腫瘤作用受到廣泛關注。但目前尚無文獻報道槲皮素聯合迷迭香酸對HepG2細胞的影響。本研究2018年1月至2019年1月選用人肝癌HepG2細胞為模型，觀察槲皮素與迷迭香酸聯合應用對HepG2細胞增殖及凋亡的影響，并探討其可能的作用機制，為其應用于肝癌的臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料試劑：10%小牛血清（四季青生物工程公司），3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT，美國sigma 公司）；槲皮素及迷迭香酸購自美國Signal Chemical公司，RPMI-1640培養基（Gibco公司）槲皮素及迷迭香酸用二甲基亞砜（DMSO）超聲溶解，配成不同質量濃度的溶液，然后用0.22 μm微孔濾器過濾，滅菌，4 ℃保存備用。

儀器：二氧化碳培養箱（美國Thermo 公司），96孔板、6孔板（美國Thermo Fisher Scientific 公司），流式細胞儀（FranklinLakes），全自動酶標儀（美國Molecular Devices 公司），實時定量PCR 儀（美國Bio-Rad），離心機（美國Bio-Rad）。

1.2 HepG2細胞培養及分組將HepG2細胞復蘇后，37 ℃、5%二氧化碳孵箱內培養培養。其中RPMI-1640 培養基內含3%小牛血清，青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL。每2～3 天傳代換液1 次，取對數生長期的細胞進行實驗。將處于對數生長期的HepG2細胞以5×104/mL 接種至96 孔板中培養24 h。分為空白對照組（只加DEME培養液），槲皮素單獨處理組（DMEM 培養液+DMSO+12.5、25.0、50.0 和100.0 μmol/L 槲皮素溶液），迷迭香酸單獨處理組（DMEM 培養液+DMSO+12.5、25.0、50.0 和 100.0 μmol/L 迷迭香酸溶液）單藥及聯合用藥組（DMEM培養液+DMSO+IC50 槲皮素+IC50 迷迭香酸），各組培養24 h后進行后續實驗。

1.3四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT法）檢測細胞活力將處于對數生長期的HepG2細胞以5×104/mL接種至96孔板中培養24 h，每孔200 μL倒掉培養液，按照上述分組操作，再培養24 h后棄液，每孔加入MTT 20 μL，繼續培養4 h后，吸去上清液，每孔加入DMSO 溶液150 mL，放至搖床低速振蕩10 min，使各孔結晶物充分溶解，采用全自動酶標儀在570 nm處測各孔吸光度。

1.4劃痕實驗將處于對數生長期的HepG2細胞接種到6孔板，調整細胞密度為5×105/mL，搖勻后與37 ℃、5%二氧化碳培養箱中常規培養過夜，用記號筆在6 孔板底部畫3 條水平直線，常規培養至90%融合狀態。用移液器在細胞板上劃痕，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗以去除懸浮細胞，同時在各藥物組中分別加入用1.5%血清培養基配置的不同濃度迷迭香酸及槲皮素，鏡下記錄劃痕寬度并拍照。37 ℃、5%二氧化碳體積分數為5%的培養箱中繼續培養36 h，倒置顯微鏡下觀察劃痕愈合程度并拍照。計算各組劃痕距離。

1.5蛋白質印跡法檢測蛋白表達收集上述各組細胞，BCA 法測定蛋白濃度，取50 μg 等量蛋白上樣，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜，封閉液室溫封1h，加入一抗N-鈣黏蛋白（N-cad）（1∶300），E-鈣黏蛋白（E-cad）（1∶500），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（1∶500）。4℃孵育過夜，加入辣根過氧化酶標記的二抗（1∶1 000），室溫孵育2 h，凝膠成像分析系統掃描分析。以GAPDH 為內參計算各組目的蛋白的表達水平。

1.6統計學方法計量資料xˉ±s表示，多組定量數據的比較采用單因素方差分析的方法，多組之間兩兩比較采用LSD-t檢驗，所有數據采用SSPS 17.0 統計軟件分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1細胞增殖結果12.5、25.0、50.0和100.0 μmol/L槲皮素對HepG2細胞抑制率分別為（16.9±3.2）%，（28.9±3.4）%，（39.6±4.2）%，（53.5±2.3）%，12.5，25，50，100 μmol/L 迷迭香酸對HepG2細胞抑制率分別為（5.2±1.2）%，（12.3±1.6）%，（39.8±2.1）%，（62.5±3.4）%；以上結果表明不同濃度槲皮素及迷迭香酸單獨作用于HepG2細胞均表現出濃度依賴性的細胞活力抑制效果，但是抑制率仍然不高。二者聯合處理人 HepG2細胞 24 h 后，12.5、25.0、50.0 和 100.0 μmol/L 對HepG2細胞抑制率分別為（25.1±3.5）%，（52.3±4.2）%，（62.5±5.1）%，（78.2±3.6）%，可顯著抑制細胞活力（F＝4.25，P＝0.02）。

2.2劃痕實驗結果25 μmol/L 迷迭香酸組及25 μmol/L槲皮素組均能抑制細胞的遷移，劃痕愈合距離分別為（11.35±2.37）mm、（11.46±3.86）mm。迷迭香酸及槲皮素聯合組劃痕愈合距離為（4.36±0.56）mm，細胞間劃痕距離縮小趨勢較迷迭香酸及槲皮素單獨使用有所減緩（F＝6.73，P＝0.003）。該結果提示槲皮素及迷迭香酸聯合組能顯著抑制細胞遷移。

2.3相關分子含量檢測蛋白質印跡法檢測結果表明：與對照組相比，槲皮素組及迷迭香酸組中N-cad蛋白表達水平下降，其蛋白相對表達量為（0.98±0.05）及（0.73±0.02）。E-cad 蛋白表達增加，其蛋白相對表達量為（1.02±0.10）及（1.25±0.14），而槲皮素+迷迭香酸組N-cad（0.61±0.07）及 E-cad（1.42±0.06）蛋白表達變化更加明顯（N-cad：F＝3.28，P＝0.03；E-cad：F＝5.28，P＝0.02）。見圖1。

圖1 蛋白質印跡法檢測各組E-鈣黏蛋白（E-cad）和N-鈣黏蛋白（N-cad）基因表達

3 討論

肝癌病死率高，預后效果不理想，治療難度大，因此迫切需要尋找一種有效治療肝癌的臨床藥物［14］。槲皮素是一種天然黃酮類化合物，具有抗氧化、抗菌消炎、抗病毒、防癌、抗癌等作用［15-16］。迷迭香酸是一種天然的苯酚羧酸，以唇形科和紫草科含量最高。迷迭香酸具有抗癌、抗過敏、抗氧化、抗炎等作用［17］。

上皮-間質轉化（EMT）是惡性腫瘤浸潤與轉移的重要因素，其過程涉及許多EMT 相關蛋白的參與。其中E-cad 和N-cad 被認為是最顯著的標志蛋白。E-cad 表達于細胞膜表面，是一個與鈣離子有高度結合親和力的一種細胞黏附糖蛋白，對維持細胞間的通訊與黏附有重要作用，在多種惡性腫瘤的遷移侵襲階段占重要地位。張杰東等［18］研究發現E-cad 在甲狀腺乳頭狀癌中低表達，與甲狀腺乳頭癌的發生、發展及轉移中起重要作用，可作為臨床診斷和預后的指標。羅婷婷等［19］研究發現E-cad能有效抑制鼻咽癌CNE-2細胞的體外遷移和侵襲。N-cad 可以克服E-cad 介導的細胞間牢固的黏附而影響上皮細胞的形態和行為，促進腫瘤細胞浸潤。但關于兩種蛋白在肝癌防治機制中的研究卻較少。

本研究以人肝癌HepG2細胞為模型，考察迷迭香酸與槲皮素聯用對N-cad 及E-cad 表達的影響，結果顯示，兩藥聯合能明顯抑制肝癌HepG2 細胞的活力，抑制細胞遷移，并呈現濃度依賴關系，并通過蛋白質印跡法檢測發現兩藥聯合使用較單獨應用迷迭香酸可顯著上調E-cad 和下調N-cad 蛋白的表達。這說明槲皮素增強迷迭香酸對肝癌HepG2細胞增殖的抑制作用的機制可能是通過調控E-cad、N-cad蛋白的表達，其機制可能與EMT有關。為肝癌的臨床治療提供了有力的實驗證據。