胰高血糖素樣肽-1 對2 型糖尿病大鼠骨髓間充質干細胞成骨和成脂分化的影響

鄧穎，黎金鳳，陳志雄，王晨秀，胡雅琴，黃水金，劉精東，程宗佑，霍亞南

作者單位：江西省人民醫院、南昌大學附屬人民醫院內分泌科，江西 南昌330000

糖尿病是一種由遺傳和環境因素共同作用引起的糖代謝紊亂的內分泌綜合征［1-3］。糖尿病可有多種并發癥，腎、神經、心血管、眼等器官的病變已廣為人知，而糖尿病合并骨質疏松的發生率也明顯增加［2，4-5］。1/2 以上的糖尿病病人骨密度降低，1/3病人被診斷為骨質疏松［2，4-5］。因此探討糖尿病合并骨質疏松的發病機制及治療手段意義重大。胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）是一種主要由腸道L細胞產生的肽類激素，具有保護胰島β細胞功能，對糖尿病小鼠具有保護作用，也對骨質疏松大鼠具有改善作用，從而提示GLP-1 可能對糖尿病合并骨質疏松大鼠具有保護作用［6-7］。因此本研究于2018 年8—12月將通過原代培養正常大鼠和2 型糖尿病（T2DM）大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs），并利用GLP-1 干預BMSCs，探討GLP-1 對糖尿病大鼠BMSCs 成骨及成脂的作用。

1 材料與方法

1.1實驗材料20 只（200±20）g、4 周齡清潔級的雄性SD大鼠，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK（湘）2016-0002，本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.2實驗試劑與儀器DMEM高糖培養基（gibco公司）；胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液（Solarbio 公司）；青鏈霉素混合液（100×）（Solarbio）；成骨誘導液（RASMX-03021-175，cyagen）；成 脂 誘 導 A 液（RASMX-03031-175，cyagen）；成 脂 誘 導 B 液（RASMX-03032-175，cyagen）；利拉魯肽注射液（諾和力公司）；茜素紅染色試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）；GLP-1（7-36）購于美國sigma 公司，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）溶解制成所需濃度。光學相差顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；流式細胞儀（美國BD公司）；Odyssey紅外熒光成像系統（美國LI-COR公司）。

1.3 T2DM大鼠模型復制將20只SD大鼠按隨機數字表法分為正常組及T2DM 組，每組10 只，正常組大鼠喂以普通飼料；T2DM 組大鼠喂以高脂飼料（其中含70%碳水化合物、20%蔗糖，10%豬油），每周測定大鼠的體質量、飲水量和進食量。于第4 周末大鼠禁食14 h 后，腹腔注射25 mg/kg 鏈脲佐菌素（STZ）溶液（STZ 溶于0.1 mol/L，pH4.5 的檸檬酸緩沖液，配制為1%的溶液），3 d 后測量隨機血糖，血糖低于16.7 mmol/mL 的再次注射STZ 溶液加強模型，隨機血糖連續2 周均高于16.7 mmol/mL 且出現糖尿病癥狀的大鼠進行后續實驗。

1.4 BMSCs的分離及培養將SD大鼠缺氧處死，75%乙醇浸泡15～20 min，無菌條件下取下脛骨和肱骨，將其兩端干骺端切除，顯露骨髓腔，用10%完全培養基徹底沖洗骨髓腔，并使骨髓細胞充分分散制成單細胞懸液，離心，棄去上清液，加入DMEM+20%胎牛血清（FBS）+雙抗培養液重懸，分別均勻的鋪在培養板中，并做好標記，標明代數，置于37 ℃，5%二氧化碳培養箱中繼續培養，3 d換1次液。當細胞的融合度達到90%以上時，棄去培養液，PBS 洗2 次，加入胰蛋白酶消化2～3 min，加入含10%FBS的完全培養基，將細胞吹打下來并吸取到10 mL離心管中，離心，棄上清，注意不要碰到管口，并接種到新的培養瓶中，置于37 ℃，5%二氧化碳培養箱中繼續培養。

1.5 BMSCs的鑒定胰蛋白酶將融合度達到80%～90%的第3 代BMSCs 消化下來并制成單細胞懸液，將細胞濃度調整為1×106/mL，分于3個已做標記的微型離心管（EP管）中，分別加入異硫氰酸熒光素（FITC）標記的CD29、CD34、CD44、CD45單克隆抗體，室溫避光孵育30 min，PBS 洗滌沒有結合的抗體，最后加入PBS重懸細胞，于流式細胞儀上檢測上述標志物的含量。

1.6 BMSCs分組正常大鼠BMSCs（正常組），正常大鼠BMSCs+10 nmol/L GLP-1（正常組+10 nmol/L GLP-1），正常大鼠BMSCs+30 nmol/L GLP-1（正常組+30 nmol/L GLP-1）。T2DM 模型大鼠 BMSCs（模型組），T2DM 模型大鼠 BMSCs+10 nmol/L GLP-1（模型組+10 nmol/L GLP-1），T2DM模型大鼠BMSCs+30 nmol/L GLP-1（模型組+30 nmol/L GLP-1）。

1.7 BMSCs成骨誘導取生長狀態良好的BMSCs，按 1×10-4個/孔接種至鋪有蓋玻片6 孔板，按照“1.6”分組加入相應濃度藥物和成骨誘導液，3 d換1次液，連續培養21 d 后做堿性磷酸酶（ALP）檢測和茜素紅染色。

1.8 BMSCs成脂誘導取生長狀態良好的BMSCs，按 1×10-4個/孔接種至鋪有蓋玻片6 孔板，按照“1.6”分組加入相應濃度藥物共同培養，成脂誘導液A 液培養3 d 換成脂誘導液B 液誘導1 d，連續培養14 d后做油紅染色。

1.9 ALP活性檢測在誘導第21 天時候，收集BMSCs，并用不含酶抑制劑的細胞裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，并用BCA 蛋白試劑盒進行定量，最后根據ALP酶活性試劑盒測定ALP活性。

1.10茜素紅染色在誘導第21天時候，去除培養基，PBS 洗滌細胞玻片，70%乙醇室溫固定細胞，茜素紅染色液覆蓋樣本，37 ℃避光孵育60 min；雙蒸水沖洗玻片3～5 min；熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照后加入10%氯化十六烷基吡啶，室溫30 min，將氯化十六烷基吡啶析出；從每個培養皿取出100 μL溶液加入96 孔板，選擇560 nm 波長進行光密度（OD）值測定，通過樣本總蛋白量對各組OD值進行標化。

1.11油紅染色在誘導第14 天，去除培養基，加入4%組織細胞固定液固定15 min；60%異丙醇充分浸潤，油紅染液染色8 min，60%異丙醇快速分化，蘇木素染色2 min，去除染色液，水洗，熒光倒置顯微鏡下觀察，鏡檢結束后加入100%異丙醇，室溫放置孵育30 min，選擇520 nm波長進行OD值測定。

1.2統計學方法所有數據均用SPSS 17.0軟件統計分析。觀測資料均為計量資料，用xˉ±s表示，多組比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05說明差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs的鑒定分離獲得的正常組大鼠BMSCs 細胞呈紡錘形或長梭形，核內可見1～2 個核仁。同時采用流式細胞術檢測BMSCs表面標志物，結果正常組及模型組大鼠的BMSCs 表面標志物CD29、CD44 陽性率均高于97%，CD34、CD45 陽性率均低于5%，從而說明本實驗獲得的BMSCs均一性較好，純度高，能夠用于后續實驗。見圖1。

2.2 ALP活性檢測與正常組（2.81±0.04）比較，正常組+10 nmol GLP-1（4.92±0.07）及正常組+30 nmol GLP-1（6.76±0.02）的ALP 活性升高，模型組（3.54±0.09）ALP 活性降低；與模型組比較，模型組+10 nmol GLP-1（5.11±0.10）及模型組+30 nmol GLP-1（5.80±0.17）的ALP活性升高（F＝23.56，P＝0.000）。說明隨著GLP-1 濃度升高，正常組及模型組成骨分化越多。

2.3茜素紅染色結果與正常組（0.46±0.05）比較，正常組+10 nmol GLP-1（0.53±0.05）及正常組+30 nmol GLP-1（0.64±0.02）的OD值升高，模型組（0.09±0.01）OD 值降低；與模型組比較，模型組+10 nmol GLP-1（0.16±0.03）及模型組+30 nmol GLP-1（0.33±0.03）的OD 值升高（F＝18.39，P＝0.001）。說明隨著GLP-1濃度升高，正常組及模型組成骨分化越多。見圖2。

2.4油紅染色結果與正常組（0.29±0.05）比較，正常組+10 nmol GLP-1（0.16±0.05）及正常組+30 nmol GLP-1（0.09±0.02）的OD值降低，模型組（0.66±0.01）OD 值升高；與模型組比較，模型組+10 nmol GLP-1（0.43±0.03）及模型組+30 nmol GLP-1（0.34±0.03）的OD 值降低（F＝29.41，P＝0.000）。說明隨著GLP-1濃度升高，可以抑制正常組及模型組的成脂分化。見圖3。

3 討論

糖尿病合并骨質疏松作為糖尿病并發癥在近些年已逐漸得到專家學者認可，其是一種全身性、代謝性、退行性的骨科疾病，是糖尿病在骨骼系統中的主要并發癥［5］。病人單位體積的骨量減少，骨強度降低，骨組織微結構改變是糖尿病骨質疏松病人主要特征，超過50%的糖尿病病人患有骨質疏松。研究顯示不管是1型糖尿病（T1DM）還是T2DM病人均較正常人群發生髖部骨折的風險高［5，8-9］。因此探討糖尿病合并骨質疏松的發病機制具有重要意義。

BMSCs是一種于1976年發現，1991年正式命名的間充質干細胞。BMSCs 來源于中胚層，能夠從臍帶、骨髓、羊水等多種組織中獲得，并能夠在誘導劑的誘導下定向分化為軟骨細胞、成骨細胞、神經細胞、心肌細胞、內皮細胞等，進而修復受損的細胞［10-12］。BMSCs 由于易分離、易培養，低免疫原性、易轉染外源基因及自我更新能力較強，因此被廣泛的應用于骨退行性疾病，神經退行行疾病，血管病性疾病等疾病的治療中［10-12］。因此本研究首先探討正常大鼠及T2DM大鼠中BMSCs的成骨及成脂分化的影響。原代培養獲得的BMSCs 經過流式細胞術鑒定發現正常組大鼠及模型組大鼠的BMSCs 表面標志物CD29、CD44陽性率均高于97%，CD34、CD45陽性率均低于5%，從而說明本實驗獲得的BMSCs均一性較好，純度高，能夠用于后續實驗。ALP 是BMSCs 向成骨細胞分化的早期標志物之一，在成骨誘導的第3 天就開始表達，是骨鈣素及鈣結節形成的前提。本研究ALP 檢測結果發現模型組BMSCs中ALP 活性低于正常組BMSCs，另外茜素紅染色結果表明模型組BMSCs 較正常組BMSCs 成骨分化減少，油紅染色結果表明模型組BMSCs 較正常組BMSCs 成脂分化增加，從而說明糖尿病對BMSCs 的成骨分化具有抑制作用，對BMSCs的成脂分化具有促進作用。

GLP-1是一種主要由腸道L細胞產生的腸促胰島素，具有保護胰島β 細胞，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡的作用［6，13-14］。GLP-1 受體是 G 蛋白偶聯受體B 家族的一員，能夠廣泛地表達于人及鼠類的胰臟、心臟、肺、腦、胃等組織［6，13-14］。GLP-1 通過結合于 GLP-1 受體，使自身的 G 蛋白 α 亞基與 β、γ 亞基解離，進而介導細胞內不同信號通路，發揮不同的生理作用［6，13-14］。研究已經顯示 BMSCs 表面能夠表達GLP-1受體，GLP-1能夠顯著的促進BMSCs增殖，抑制BMSCs凋亡［15-17］。另外還有研究顯示GLP-1類似物唾液素-4（Exendin-4）能夠促進 BMSCs 向成骨細胞分化，同時還有改善大鼠骨質疏松作用［7，18-19］。進而提示GLP-1對骨的保護作用。因此本研究將不同濃度的GLP-1加入到正常組大鼠及T2DM大鼠的BMSCs，結果發現GLP-1 不論是對正常大鼠的BMSCs 還是T2DM 大鼠的BMSCs 均具有成骨分化的促進作用，而對成脂分化具有抑制作用。

綜上所述，T2DM 大鼠BMSCs 較正常大鼠BMSCs的成骨轉化作用減少，成脂作用增加。GLP-1的加入能顯著的促進T2DM 大鼠BMSCs 及正常大鼠BMSCs的成骨作用，減少成脂作用，從而說明GLP-1對T2DM 大鼠BMSCs 的成骨分化具有促進作用，對成脂分化具有抑制作用。

（本文圖1～3見插圖9-2）

圖1 流式細胞儀檢測各組大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs）表面標志物：A為正常組，B為正常組+10 nmol/L胰高血糖素樣肽-1（GLP-1），C為正常組+30 nmol/L GLP-1，D為模型組，E為模型組+10 nmol/L GLP-1，F為模型組+30 nmol/L GLP-1 圖2 各組大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs）成骨分化熒光倒置顯微鏡圖片（茜素紅染色×200）：A為正常組，B為正常組+10 nmol/L胰高血糖素樣肽-1（GLP-1），C為正常組+30 nmol/L GLP-1，D為模型組，E為模型組+10 nmol/L GLP-1，F為模型組+30 nmol/L GLP-1 圖3 各組大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs）成脂分化熒光倒置顯微鏡圖片（油紅○染色×200）：A為正常組，B為正常組+10 nmol/L胰高血糖素樣肽-1（GLP-1），C為正常組+30 nmol/L GLP-1，D為模型組，E為模型組+10 nmol/L GLP-1，F為模型組+30 nmol/L GLP-1