表沒食子兒茶素沒食子酸酯促進2 型糖尿病傷口愈合的實驗研究

張彥，汪天賜，蔡婧，李亞娟

作者單位：1空軍軍醫大學第一附屬醫院腎臟內科，陜西 西安710032；2空軍軍醫大學軍事生物醫學工程學系，陜西 西安710032

2型糖尿病是最常見的慢性老年性疾病之一，占糖尿病病人總人口的九成以上。隨著全世界老齡化問題的日益嚴峻，2 型糖尿病病人數量也在逐年上升［1-2］。2型糖尿病會累積機體的多個系統產生慢性并發癥，而其自身的創傷修復困難問題也是長期困擾醫務人員的一個重要難題，嚴重威脅著病人的生理和心理健康［3］。機體系統代謝紊亂、自身免疫力下降、創傷部位細菌繁殖、加劇的炎癥反應等都是誘發2型糖尿病創傷愈合困難的關鍵因素［4-5］。目前臨床上應對2型糖尿病創傷愈合問題仍以控制血糖為主要手段，但是仍缺乏有效且安全的治療方法。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是綠茶茶多酚中的核心化學成分，其抗菌、抗氧化、抗腫瘤等功效已得到大量的動物和臨床研究證實［6-9］。近年來的研究也發現，EGCG 能夠憑借其顯著的抗炎癥反應功效，在促進正常和1型糖尿病軟組織創傷愈合中發揮重要作用［10-12］。但是，EGCG能否顯著改善發病人群更廣泛的糖尿病類型——2型糖尿病的創傷修復困難問題，迄今仍未有研究記載。本實驗于2015年1月至2016年1月通過應用瘦素受體缺陷的2型糖尿病db/db小鼠作為動物模型，系統評價EGCG對于2型糖尿病傷口愈合的治療效果。

1 材料與方法

1.1實驗動物、實驗試劑及儀器設備2 型糖尿病db/db 小鼠 32 只［BKS.Cg-m+/+Leprdb/J，3 月齡，雄性，無特定病原體（SPF）級，體質量（41.50±7.95）g］，以及與它們相同背景的雄性野生型小鼠16只，體質量（19.72±2.85）g，全部購于南京生物醫藥研究院（協議許可編號：NBRI［2014］314），醫學實驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）20120001；EGCG，購于美國Sigma 公司；麻醉藥戊巴比妥鈉緩沖液，購于美國Sigma-Aldrich 公司；血糖測試儀，購于美國Johnson&Johnson公司；3M Tegaderm透明薄膜敷貼，購于美國3M Healthcare 公司；伺服式生物力學萬能材料測試機，購于東莞市昆侖檢測儀器公司；用于拍攝傷口圖像的照相機，購于日本Canon公司；小鼠軟組織酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，購于武漢華美生物公司；激光多普勒血流測量系統以及與其配套的皮膚接觸探頭，購于英國Moor Instruments公司。

1.2背部軟組織創傷模型構建及EGCG治療本研究獲空軍軍醫大學實驗動物倫理學委員會批準（許可編號：20140209），所有涉及動物實驗的操作步驟與實驗流程均按照協議規定嚴格執行。所有小鼠抵達本實驗室后，適應1周后開始正式實驗。1周后，于上午（8～10時）對全部小鼠進行尾部提取靜脈血，使用血糖測試儀測量隨機血糖水平，血糖水平＞16.7 mmol/L的實驗動物認定模型達到標準，即被納入實驗。本研究被劃分為野生型小鼠組（Control）、db/db 小鼠組（db/db）及 db/db 施以 EGCG 治療組（db/db+EGCG）共三組，每組動物樣本量n＝16。在全部48 只小鼠的背部手術創建一處皮膚損傷模型，主要操作流程包括：以戊巴比妥鈉腹腔注射的形式對各組動物進行麻醉，通過應用皮膚活檢針在所有小鼠的背部構建1 個直徑為1 cm 的圓形傷口，確保與皮膚、真皮和肌膜充分剝離，并覆蓋以3M薄膜敷貼。隨后皮下注射青/鏈霉素預防潛在的創傷感染。分別在術后第5、12、19天對每組4只動物施以過量戊巴比妥鈉安樂死，對于每組余下4 只動物用于定量評價傷口完全愈合所花費的時長。db/db+EGCG組實驗動物在組織損傷模型建立后立即予以每日的EGCG（10 mg/kg）灌胃處理。

1.3小鼠傷口組織局部血流速率的測試分析于軟組織創傷模型構建的第5、12、19 天，通過應用激光多普勒血流測量系統對小鼠背部傷口位置的局部血流速率進行定量測試分析。主要測量步驟為：將激光多普勒測量儀的探頭放置于小鼠傷口的正中央位置，探頭由激光發射器經發生纖維將激光束（780 nm波長）照射至傷口位置，通過探頭內的接收纖維陣列將光信號以40 Hz的采樣速率采集傳遞至多普勒的信號處理系統中，最后經自動的數據處理獲得小鼠傷口位置的最終局部血流速數值。

1.4小鼠軟組織傷口愈合率的測試評估于軟組織創傷建立的術后0、5、12、19天進行背部軟組織創傷的圖像采集。主要步驟包括：將戊巴比妥鈉麻醉的動物固定在解剖手術臺上，確保動物無任何微移動，數碼相機通過三腳架精確固定在小鼠背部傷口位置正上20 cm，待視野充分穩定后進行圖像采集。使用自行編寫的Matlab 軟件程序對圖像中的創傷區域進行圖像處理與分析（包括顏色閾值分割算法、局部自適應邊緣提取算法等）。待軟件分析完畢后，獲得創傷位置的面積數值，通過公式計算傷口愈合率，作為評價軟組織愈合進度的標尺：傷口愈合率＝（第0 天傷口面積-第n天傷口面積）/第0天傷口面積×100%。

1.5小鼠創傷組織生物力學抗張強度的測試評估待傷口愈合率測試完畢后，對各時間點的小鼠背部軟組織進行取材分離，使用手術剪將皮膚軟組織生物標本修剪為8 mm2×8 mm2的正方形狀，隨后迅速浸泡于0.9%氯化鈉溶液平衡緩沖液中以避免組織干燥。使用伺服式生物力學萬能材料測試機對軟組織進行力學拉伸測試，主要步驟為：力學測試機的兩個預制夾具將軟組織標本夾緊，確保傷口與夾具水平對稱，施加1 N的力預加載將樣本拉緊，待穩定后以20 mm/min的位移速度反向移動兩個夾具，從而在組織標本產生軸向拉神應力載荷，系統自動記錄應力與位移的時間變化關系，獲取組織標本發生完全破裂時的斷裂載荷作為實驗指標。

1.6小鼠傷口組織的ELISA測試評估力學試驗結束后，取各組小鼠創傷位置余下的組織樣本用作ELISA測試。使用武漢華美生物公司的小鼠ELISA檢測試劑盒對軟組織中白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、血管內皮生長因子（VEGF）的表達進行測試（貨號分別為CSB-E08054m、CSB-E04639m、CSB-E04741m 和CSB-E04756m）。所有實驗操作步驟均按照試劑盒的說明執行。ELISA 檢測基于雙抗體夾心法原理，整個過程包括酶標板包被、血清樣本上樣、加入酶標抗體、加入底物液顯色、終止反應以及酶標儀吸光度檢測，每個樣本設置3個復孔，取測量平均值。

1.7統計學方法實驗數據均以xˉ±s表達，統計學檢測應用SPSS 22.0 軟件。使用單因素方差分析結合Bonferroni 校正法分析來進行三組實驗數據的每兩組之間的比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EGCG對于2型糖尿病db/db小鼠血糖和體質量的影響如圖1A所示，三組小鼠體質量比較的單因素方差分析在術后的第5、12、19天的F值分別為78.677、55.069 和 23.499，P值均小于 0.001。db/db小鼠在軟組織傷口模型構建的第5、12、19天的體質量值分別為（42.5±4.7）g、（44.6±5.5）g 及（45.1±6.1）g，而Control組小鼠體質量在各時間點分別為（20.3±2.5）g、（21.2±1.9）g及（22.6±2.3）g，db/db組顯著高于Control 組小鼠（P＜0.01），而db/db+EGCG 組小鼠的體質量值在第 5、12、19 天分別為（43.6±7.1）g、（45.5±6.9）g及（47.1±7.2）g，均顯著高于Control組（P＜0.01），但是與db/db 小鼠的體質量值在各時間點差異無統計學意義（P＞0.05）。

如圖1B所示，三組小鼠血糖比較的單因素方差分析在術后的第 5、12、19 天的F值分別為 80.251、59.812和29.918，P值均小于0.001。db/db小鼠在軟組織傷口模型構建的第5、12、19天的隨機血糖值分別為（21.5±2.6）mmol/L、（19.8±2.1）mmol/L 及（20.6±2.7）mmol/L，而Control 組小鼠體質量在各時間點分別為（6.1±0.9）mmol/L、（5.4±0.7）mmol/L及（5.7±0.9）mmol/L，db/db組顯著高于Control組小鼠（P＜0.01）。db/db+EGCG 組小鼠的體質量值在第 5、12、19 天分別為（23.1±3.5）mmol/L、（22.4±3.9）mmol/L 及（22.5±3.8）mmol/L，均顯著高于Control組（P＜0.01）。但是db/db 組與db/db+EGCG 組在術后各時間點的血糖值差異無統計學意義（P＞0.05）。而Control、db/db、db/db+EGCG 三組小鼠組內在術后第 5、12、19 天的體質量和血糖均未發生顯著性變化（P＞0.05），表明各組小鼠的體質量和血糖因素在術后19 天內并未發生明顯改變。

圖1 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對于2型糖尿病db/db小鼠體質量（A）和血糖（B）的影響

圖2 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）治療對于2型糖尿病db/db小鼠傷口愈合速率（A）和總愈合時間（B）的影響

2.2 EGCG對于2型糖尿病db/db小鼠傷口愈合率和總愈合時間的影響三組小鼠在傷口模型構建的第5、12、19 天的傷口愈合率的比較結果如圖2A所示。三組間傷口愈合率比較的單因素方差分析在術后的第5、12、19天的F值分別為20.953、20.788和22.543，P值均小于0.001。db/db小鼠在術后的第5、12、19 天的傷口愈合率分別為（10.1±2.0）%、（39.1±5.2）%及（59.2±6.2）%，均顯著低于Control 組在各時間點的傷口愈合率，分別為（22.1±3.0）%、（60.3±4.5）%及（85.4±5.9）%，三個時間點的統計P值均小于0.001；而db/db+EGCG 組小鼠在術后的第5、12、19天的傷口愈合率均顯著高于對應時間點的db/db 小鼠［（19.4±3.2）%比（10.1±2.0）%，P＝0.003；（55.2±4.8）%比（39.1±5.2）%，P＝0.003；（79.7±5.2）%比（59.2±6.2）%，P＝0.002］。本研究也發現，db/db+EGCG 組小鼠在術后各時間點的傷口愈合率與Control 組差異無統計學意義（P值分別為0.583、0.523 和0.603）。三組小鼠總愈合時間的對比結果如圖2B 所示。三組間傷口愈合時間比較的單因素方差分析的F值為14.153、P值為0.002。與Control組小鼠相比，db/db組小鼠的傷口總愈合時間顯著延長，（39.9±5.4）d 比（22.9±4.3）d，P＝0.003；而db/db+EGCG 組小鼠的傷口愈合時間顯著低于db/db 組小鼠，（25.1±4.9）d 比（39.9±5.4）d，P＝0.006。本研究也發現，db/db+EGCG 組小鼠的傷口愈合時間與Control組差異無統計學意義（P＝0.999）。

2.3 EGCG對于2型糖尿病db/db小鼠傷口組織生物力學抗張強度的影響Control、db/db、db/db+EGCG 三組小鼠在傷口模型構建的第5、12、19 天的傷口組織生物力學抗張強度的比較結果如圖3 所示。三組間傷口組織生物力學抗張強度比較的單因素方差分析在術后的第5、12、19天的F值分別為25.885、16.801 和 20.322，P值均小于 0.001。db/db小鼠的傷口組織生物力學抗張強度在術后的第5、12、19 天均顯著低于空白對照的Control 組，分別為（4.5±0.9）kg/mm2比（9.5±1.1）kg/mm2；（7.8±1.0）kg/mm2比（12.2 ± 2.0）kg/mm2；（10.2 ± 1.5）kg/mm2比（18.3±2.1）kg/mm2，三個時間點的統計P值均小于0.001；但是，db/db+EGCG組小鼠在傷口模型構建的第5、12、19天的傷口組織生物力學抗張強度均顯著高于db/db 組小鼠，分別為（8.0±1.0）kg/mm2比（4.5±0.9）kg/mm2，P＝0.003；（12.2±1.7）kg/mm2比（7.8±1.0）kg/mm2，P＝0.009；（16.2±2.0）kg/mm2比（10.2±1.5）kg/mm2，P＝0.004。本研究也發現，db/db+EGCG組小鼠在術后各時間點的傷口組織生物力學抗張強度與Control 組差異無統計學意義（P值分別為0.179、0.300和0.458）。

圖3 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對于2型糖尿病db/db小鼠傷口組織生物力學抗張強度的影響

圖4 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）治療對于2型糖尿病db/db小鼠傷口組織位置局部血流速度的影響

2.4 EGCG對于2型糖尿病db/db小鼠傷口組織位置局部血流速率的影響Control、db/db、db/db+EGCG 三組小鼠在傷口模型構建的第 5、12、19 天的傷口組織位置局部血流速率的比較結果如圖4 所示。三組間傷口組織局部血流速率比較的單因素方差分析在術后的第5、12、19 天的F值分別為19.786、69.561 和 38.748，P值均小于 0.001。db/db小鼠在術后第5、12、19天的傷口組織位置局部血流速率分別為（0.51±0.08）、（0.39±0.12）和（0.49±0.13），而Control組在術后各時間點的傷口組織位置局部血流速率分別為（1.00±0.12）、（1.35±0.11）和（1.24±0.13），db/db組均顯著低于Control組，三個時間點的統計P值均小于0.001；而db/db+EGCG 組小鼠在術后的第5、12、19天的傷口組織位置局部血流速率均顯著高于db/db組小鼠［（0.78±0.12）比（0.51±0.08），P＝0.020；（1.08±0.13）比（0.39±0.12），P＝0.001；（1.01±0.11）比（0.49±0.13），P＝0.001］。本研究也發現，db/db+EGCG 組小鼠在術后各時間點的傷口組織位置局部血流速率也顯著低于Control 組（P值分別為0.047、0.036和0.048）。

2.5 EGCG對于db/db小鼠傷口組織中重要細胞因子蛋白表達的影響三組小鼠在傷口模型構建的第5、12、19天的傷口組織中重要細胞因子表達的比較結果如圖5 所示。三組間IL-1β 比較的單因素方差分析在術后的第5、12、19 天的F值分別為21.145、59.281 和 23.162，P值均小于 0.001。db/db小鼠在術后第5、12、19 天的傷口組織IL-1β 表達量分別為（205.4±15.4）pg/mL、（271.4±26.3）pg/mL 和（187.5±18.2）pg/mL，而db/db+EGCG 組在術后各時間點 IL-1β 表達量分別為（162.1±15.5）pg/mL、（200.8±20.2）pg/mL和（139.2±17.8）pg/mL，均顯著低于db/db組（P＜0.01）。三組間IL-6比較的單因素方差分析在術后的第5、12、19 天的F值分別為23.295、66.094 和 26.108，P值均小于 0.001。db/db小鼠在術后第5、12、19 天的傷口組織IL-6 表達量分別為（244.4±18.3）pg/mL、（322.9±31.3）pg/mL 和（233.2±21.7）pg/mL，而db/db+EGCG 組在術后各時間點 IL-6 表達量分別為（181.2±18.2）pg/mL、（235.3±19.2）pg/mL 和（159.2±17.5）pg/mL，均顯著低于db/db 組（P＜0.01）。三組間TNF-α 比較的單因素方差分析在術后的第5、12、19 天的F值分別為 18.055、30.762 和 35.471，P值均小于 0.001。db/db 小鼠在術后第 5、12、19 天的傷口組織 TNF-α 表達量分別為（962.7±92.9）pg/mL、（1169.2±104.6）pg/mL 和（870.8±87.1）pg/mL，而db/db+EGCG 組TNF-α表達量分別為（771.2±79.2）pg/mL、（998.4±107.4）pg/mL 和（621.5±81.2）pg/mL，均顯著低于 db/db 組（P＜0.01）。三組間VEGF 比較的單因素方差分析在術后的第 5、12、19 天的F值分別為 22.098、50.117 和 30.005，P值均小于 0.001。db/db 小鼠在術后第 5、12、19 天的傷口組織 VEGF 表達量分別為（395.1± 36.7）pg/mL、（430.2± 28.2）pg/mL 和（377.5±26.8）pg/mL，而 db/db+EGCG 組 VEGF 表達量分別為（442.1±29.2）pg/mL、（490.2±24.3）pg/mL和（430.2±22.6）pg/mL，均顯著高于db/db 組（P＜0.01）。

3 討論

EGCG 作為從綠茶中提取的一種成分，是綠茶中最主要的活性和水溶性成分。大量研究證實，EGCG 具有非常強的抗氧化和抗炎抑菌功效，并被發現在抗腫瘤及治療心血管疾病中發揮了積極作用［6-8］。雖然近年來的研究也發現EGCG 能夠加速正常和1 型糖尿病軟組織的創傷愈合［9-12］，但是EGCG 是否能夠對于更為棘手且發生率更高的2 型糖尿病的傷口愈合修復產生積極效果尚未見研究報道。本實驗中使用了db/db 小鼠動物模型作為2型糖尿病研究的實驗工具。db/db 小鼠是瘦素受體特異性缺陷的基因修飾小鼠，瘦素作為脂肪組織分泌的激素分子，能夠作用于下丘腦的代謝調節中樞，發揮抑制食欲，減少能量攝取，抑制脂肪合成的作用。而瘦素受體缺陷的db/db 小鼠則表現出肥胖、高血糖、多飲、多尿、多食等與臨床2 型糖尿病相似的體征，而該模型小鼠也是目前實驗室中對于2型糖尿病及其并發癥研究的最常用的動物模型之一［13-15］。

圖5 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）治療對于2型糖尿病db/db小鼠傷口組織中重要細胞因子表達的影響：A為白細胞介素1β（IL-1β）；B為白細胞介素6（IL-6）；C為腫瘤壞死因子α（TNF-α）；D為血管內皮生長因子（VEGF）

本研究發現，db/db小鼠在術后的各時間點的傷口愈合速率均顯著低于空白對照組小鼠，同時db/db小鼠的創傷總愈合時間顯著高于空白對照小鼠，提示2 型糖尿病的db/db 小鼠的傷口愈合進程顯著延遲，這與臨床上2型糖尿病的傷口愈合特征類似［16］。本研究使用EGCG（10 mg/kg）對db/db小鼠的創傷進行治療，該劑量已被諸多先前研究證實能夠顯著加速傷口的愈合和修復［11，17］。本研究結果發現，EGCG（10 mg/kg）在術后的各時間點均能夠顯著提升db/db 小鼠的傷口愈合速率，并能夠顯著縮短db/db 小鼠傷口愈合的總時長。本研究結果提示，EGCG 具有改善2型糖尿病db/db小鼠軟組織創傷愈合障礙，加速傷口愈合修復的作用功效。

本研究生物力學測試結果表明，db/db小鼠的傷口外周組織的抗張強度顯著低于空白對照的Control 組小鼠，提示2 型糖尿病的db/db 小鼠傷口組織硬度和韌性顯著降低。而軟組織的抗張強度大小主要由膠原纖維的數量和排列所決定的［18］，因此本研究結果表明db/db小鼠傷口愈合速率降低與傷口位置膠原纖維的破壞部分相關。而本研究進一步揭示，EGCG（10 mg/kg）在術后的各時間點均顯著提升了db/db 小鼠傷口組織的生物力學抗張強度，提示EGCG能夠顯著抑制2型糖尿病傷口及其外周組織的膠原蛋白破壞進程。

創傷發生后，其局部微環境的血流供應在整個傷口的修復進程中發揮重要作用。而大量研究也提示，2 型糖尿病的傷口修復功能障礙也與其高糖環境所誘發的局部微循環障礙具有密切關聯［19］。本研究通過激光多普勒血流測量發現，db/db小鼠傷口位置的局部血流速率在術后的各時間點均顯著低于空白對照的Control 組小鼠，提示2 型糖尿病的db/db 小鼠在傷口發生后的修復進程中會全程伴隨著局部的微循環障礙這一問題。同時，本研究ELISA結果也揭示，對于血管新生起重要作用的細胞因子VEGF的表達，db/db小鼠在各時間點均顯著低于Control 組小鼠，進一步揭示了2 型糖尿病小鼠會發生血管新生能力的顯著降低。而本研究也發現，EGCG（10 mg/kg）治療在術后各時間點均能夠顯著提高db/db 小鼠傷口位置的局部血流速度；同時，EGCG 治療也在術后各時間點顯著提升了db/db 小鼠傷口位置VEGF的表達。本研究結果提示，EGCG能夠顯著改善2型糖尿病創傷部位的局部微循環狀態，促進傷口處的血管新生。

炎癥反應是軟組織的創傷發生過程的一個關鍵環節，而諸多先前的研究表明2 型糖尿病傷口愈合修復中長期處于高炎癥反應狀態，這會顯著降低其傷口的修復速率［20］。本研究發現db/db小鼠傷口位置的炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平在術后各時間點均顯著高于Control 組小鼠，提示2 型糖尿病的db/db小鼠在創傷發生后長期處于局部高炎癥反應狀態。而EGCG（10 mg/kg）治療在術后的各時間點均顯著降低了db/db 小鼠傷口處IL-1β、IL-6和TNF-α水平。本研究結果提示，EGCG的促2型糖尿病傷口愈合效應與其顯著的抗炎癥反應密切相關。

綜上所述，本研究通過形態學、組織學、生物力學等角度系統揭示了EGCG能夠有效改善2型糖尿病db/db 小鼠的傷口愈合能力，而這一積極效應與EGCG顯著的抗炎癥反應、促血管新生、加速膠原沉積密切相關。本研究提示EGCG作為一種經濟易得的中藥成分，具有可觀的治療2 型糖尿病傷口愈合障礙的臨床應用前景。