反相高效液相色譜法測定人血清中拉莫三嗪的濃度

王曉娟，袁君，黃慶，趙伍西

作者單位：1淮南市第一人民醫院藥學部，安徽 淮南232007；2淮南聯合大學醫學系，安徽 淮南232007

拉莫三嗪（lamotrigine）是一種電壓門控式鈉離子通道阻滯劑，為廣譜抗癲癎藥，廣泛用于控制各種類型的癲癎發作，被抗癲癎藥物應用專家共識［1］癲癎（2011 年）列為健康育齡期婦女特發性全面性癲癎及癥狀性部分性癲癎的首選用藥。但由于拉莫三嗪受遺傳因素、聯合用藥等因素影響，有效血藥濃度個體差異大，與劑量相關性差，治療窗窄，因此臨床應用需進行拉莫三嗪的血藥濃度監測［2-6］。本研究于 2013 年 5 月至 2016 年 5 月查閱相關文獻［7-9］建立了人體血清拉莫三嗪濃度的反相高效液相色譜方法，測定時間縮短，線性范圍擴大，準確性提高，適用于拉莫三嗪血藥濃度的臨床常規監測，為拉莫三嗪的個體化治療提供科學依據。

1 儀器與試劑

1.1儀器Agilent1260 高效液相色譜儀，DADG1316A 檢測器；FA1104 電子天平（上海良平儀器廠）；XW-80A 渦旋振蕩器（上海醫科大學儀器廠）；H-1850R 型號離心機（湖南湘儀儀器廠）；高純度氮氣和氮吹儀（BYDCY-24S）；DK-420數顯恒溫水浴鍋（上海三發科學儀器有限公司），D1810C自動雙重純水蒸餾器（上海申勝生物技術有限公司）。

1.2試劑拉莫三嗪對照品、艾司唑侖對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號10075-20041、1219-0102）；乙腈含量≥99.9%（色譜純，批號S92150，sigma 公司）；正戊烷含量≥98.5%（色譜純，上海凌峰化學試劑有限公司，批號20150310）；甲醇含量≥99.8%、乙酸乙酯含量≥99.5%、氯仿含量≥99.5%（均為色譜純，國藥集團化學試劑有限公司，批號分別為20141022、20151202、20150921）；磷酸二氫鈉含量≥99.5%（天津市光復科技有限公司，批號20140731）；自制重蒸餾水；正常人空白混合血清（淮南市第一人民醫院檢驗科提供）。

1.3溶液的配制拉莫三嗪儲備液配制：精密稱取拉莫三嗪對照品25 mg，加入甲醇溶解，定容到100 mL容量瓶中，得250 mg/L拉莫三嗪儲備液。艾司唑侖內標液配制：精密稱取艾司唑侖對照品38.6 mg，加甲醇溶解，定容到50 mL 容量瓶中，得濃度為772 mg/L的艾司唑侖內標液。上述溶液放置在4 ℃冰箱保存備用。

2 方法與結果

2.1色譜條件色譜柱規格Agilent C18（4.6×150 mm，5 μm）（Agilent公司）；流動相配比為甲醇∶磷酸二氫鈉緩沖液（56∶44，pH 6.0）；流速1.0 mL/min；檢測波長210 nm，液相色譜柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

2.2樣品處理精密吸取艾司唑侖內標液10 μL于離心管中氮氣吹干，加人混合血清樣品100 μL，乙酸乙酯 600 μL 渦旋 2 min，離心 5 min（8 000 r/min）。取出上清液，下層再次加入600 μL 乙酸乙酯，渦旋2 min，離心5 min（8 000 r/min），合并兩次上清液。55°C水浴，氮氣吹干，殘渣用流動相100 μL溶解，混勻30 s，離心5 min（8 000 r/min），于“2.1 色譜條件”下取10 μL進樣測定。

2.3方法專屬性取空白血清按“2.2”項下方法處理分析，拉莫三嗪和內標峰型良好，兩者保留時間分別為3.8 min 和11.5 min，空白血清內源性物質不干擾測定。按照上述方法考察同時加入卡馬西平、苯妥英鈉及丙戊酸鈉對實驗的干擾，卡馬西平及苯妥英鈉保留時間分別為7.4 min和6.5 min，丙戊酸鈉無峰，三者均不干擾拉莫三嗪測定。結果見圖1。

2.4標準曲線與線性范圍拉莫三嗪儲備液用甲醇稀釋，配成濃度分別為 0.10、0.50、2.50、10.00、25.00、50.00、100.00 mg/L 的拉莫三嗪標準液。按2.2 項下方法處理進樣測定。以拉莫三嗪與內標峰面積比值為縱坐標（Y），拉莫三嗪質量濃度為橫坐標（X），進行線性回歸。得拉莫三嗪回歸方程Y＝0.020 1X+0.025 2（r＝0.999 6），在0.10～100.00 mg/L范圍內線性關系良好，定量下限為0.10 mg/L。

2.5精密度和回收率取空白血清100 μL，準確加入一定量的拉莫三嗪標準儲備液，配制低、中、高質量濃度分別為0.25、2.50 和25.00 mg/L 的拉莫三嗪質控血清，每個濃度各5份，取上述系列濃度的標準質控血清樣品，按“2.2”項下方法操作，以當日回歸方程計算各藥物濃度，以加入質量濃度與實測質量濃度之比計算相對回收率。上述3種濃度的標準質控血清樣品在同一天內分別測定3 次和連續3 d 每天測定1 次，測得的血藥濃度計算日內精密度和日間精密度，結果見表1。

2.6穩定性取2.5項方法配制的0.25、2.50、25.00 mg/L 濃度的拉莫三嗪質控血清，室溫放置24 h，-20 ℃冰凍7 d 和-20 ℃冰凍1個月的穩定性。按“2.2”項下方法操作，分別測定拉莫三在室溫放置24 h 和-20 ℃冷凍 7 d、1 個月前后的拉莫三嗪峰面積之比，相對標準偏差（RSD）分別為1.5%、1.2%及0.9%，表明在此條件下，拉莫三嗪穩定性良好。

圖1 拉莫三嗪和艾司唑侖的反相高效液相色譜圖：A為空白血清圖；B為拉莫三嗪血清圖；C為拉莫三嗪+艾司唑侖血清圖

表1 人血清中拉莫三嗪的精密度和回收率

3 討論

以艾司唑侖為內標，而非文獻報道［10-11］的氯唑沙宗，因可能需要同時監測卡馬西平、苯巴比妥、苯妥英鈉等藥物的血濃度，可以縮短實驗時間和節約檢測成本，但多種成分同時監測，拉莫三嗪與苯巴比妥分離度較差，還需進一步優化。流動相的組成、比例選擇參考相關文獻［12-13］，甲醇與水，或乙腈與水影響拉莫三嗪和內標峰型，而采用甲醇∶磷酸二氫鈉緩沖液（56∶44，pH 6.0）峰型較為理想。乙酸乙酯作為萃取溶劑，比乙醚、乙酸乙酯、氯仿、正戊烷毒性低，雜質峰少，回收率高而穩定，分離效果好。但乙酸乙酯揮發慢，因此血樣處理采用55°C水浴，氮氣吹干。

應用本方法監測數百例服用拉莫三嗪病人的血清藥物濃度，所有病人的血清濃度均在0.10～100.00 mg/L線性之內，無特殊情況當天可以出監測報告，說明該方法方便、快捷、準確，能夠滿足拉莫三嗪血清濃度的臨床常規監測需要，給臨床癲癎病人拉莫三嗪個體化治療提供科學、準確的用藥依據。