miR-216a 抑制 Kruppel 樣轉錄因子 9 調控核因子-κB信號通路對腎小管上皮細胞急性腎損傷的影響

萬笑笑

作者單位：江西省人民醫院腎內科，江西 南昌330006

缺血缺氧是導致急性腎損傷的重要原因，在缺血缺氧狀態下，機體炎癥信號通路被激活，并產生大量炎性因子加劇腎損傷［1-2］。核因子-κB（NF-κB）是細胞內常見的信號通路，與缺血再灌注損傷后引起的炎癥反應密切相關［3-5］。miR-216a 是 miR-216家族成員之一，能夠廣泛地表達于心、肝、脾、肺、腎等組織中，并在胰腺中表達量最高，但在急性胰腺炎中低表達，并與胰腺損傷嚴重程度有關，因此被作為急性胰腺炎發作時胰腺損傷的潛在標志物［6-8］，但miR-216a在急性腎損傷中表達情況未知，本課題組推測其可能作為急性損傷診斷的標志物。同時miR-216a 能夠通過抑制高遷移率族蛋白B1（HMGB1）/NF-κB 信號通路阻斷過氧化氫誘導的人支氣管上皮細胞氧化應激損傷［9］，進而提示miR-216a 對 NF-κB 信號通路的調控作用。Kruppel樣轉錄因子（Kruppel-like factor，KLF）是一類高度保守的轉錄因子，有3 個亞族，KLF9 屬于亞族3，能夠通過促進過氧化物酶體活化受體γ，進而調控糖異生過程，因此KLF9是糖尿病腎病發生的標志物［10］。所以本研究于2018年1—4月通過缺氧-復氧（H/R）復制體外急性腎損傷模型，進而探討miR-216a在此模型中的表達及相關機制。

1 材料與方法

1.1材料293T細胞（人腎上皮細胞系）、大鼠腎臟近端腎小管上皮細胞系RPTC購于美國典型培養物保藏中心（ATCC）。

胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液購于Solarbio公司，批號T1300；Lipofectamine? 3000購于invitrogen公司，批號 18882752；OPTI-MEM?I（1×）、MEM NEAA 培養基（100×）購于gibco，批號331985-062、11140-050；DMEM培養基完全高糖培養液購于南京凱基生物技術有限公司，批號KGM12800S-500；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于上海翊圣生物技術有限公司，批號 D28310；Trizon Reagent、Ultrapure RNA超純RNA提取試劑盒、HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒批號、UltraSYBR Mixture、miRNA Purification miRNA 提取試劑盒、miRNA cDNA Synthesis miRNA逆轉錄試劑盒、miRNA qPCR Assay Kit購于北京康為世紀生物科技有限公司，批號CW0580S、 CW0581M、 CW2569M、 CW0957M、CW0627S、CW2141S、CW2142S。

TGL16D臺式冷凍離心機購于常州中捷實驗儀器制造有限公司；TCT8-II PCR儀購于上海領成生物技術有限公司；YM100立式蒸汽壓力滅菌鍋購于三申醫療器械有限公司；DHG-9070 電熱鼓風干燥箱購于上海恒科科技發展有限公司；C-1 厭氧袋購于日本三菱；BPN-80CW 二氧化碳培養箱購于上海一恒科學儀器有限公司；ZOETM熒光細胞成像儀購于Bio-Rad；SPARK10 多功能酶標儀購于TECAN；UV-1600PC 紫外可見分光光度計購于上海美譜達儀器有限公司；CFX Connect?實時熒光 PCR 儀，Chemi DocTM XRS+超高靈敏度化學發光成像系統購于伯樂生命醫學產品（上海）有限公司。

1.2雙熒光素酶實驗載體構建運用miRDB 軟件檢索出KLF9基因3'-UTR與miRNA的結合位點：根據KLF9基因3'-UTR與miRNA的結合位點，構建熒光素酶載體，引入酶切位點（XhoI/XbaI）生物合成基因片段（克隆至pmirGL0載體上）。

1.3雙熒光素酶檢測將細胞分為KLF9野生型載體、miR-216a mimics（類似物）+KLF9 野生型載體、miR-216a NC（陰性對照）+KLF9 野生型載體。吸盡細胞培養液后用1×磷酸緩沖鹽溶液（PBS）潤洗2遍后加入細胞裂解液；將樣本、螢火蟲熒光素酶檢測試劑、Renilla 熒光素酶檢測試劑平衡至室溫后再進行以下操作：每孔加入100 μL螢火蟲熒光素酶檢測試劑，加入20 μL樣本，用移液器輕柔吹打混勻后讀數；以細胞裂解液為空白對照；每孔加入100 μL Renilla 熒光素酶檢測試劑，使用酶標儀震蕩混勻后讀數。在以Renilla熒光素酶為內參的情況下，用螢火蟲熒光素酶測定得到的相對光單位（RLU）值除以Renilla 熒光素酶測定得到的RLU 值。根據得到的比值來比較不同樣本間目的報告基因的激活程度。

1.4細胞轉染當6孔板中細胞密度達90%時，準備轉染。將不含血清的培養基取出復溫，細胞的培養基更換為不含血清的培養基，體積為1 mL；取滅菌的微型離心管（EP 管）2 個，每管加125 μL Opti-MEM。其中一管加入5 μL Lipofectamine? 3000；另一個EP管，加入5 μL P3000，質粒2.5 μg，輕輕混勻后室溫靜置5 min；將上述兩個EP管混勻，室溫靜置60 min，將混合液滴到6孔板中對應的孔內，將細胞放回孵箱培養，轉染4 h后在6孔板中加入血清含量為20%的完全培養基1 mL；48 h后進行檢測。

1.5細胞H/R處理將大鼠腎臟近端腎小管上皮細胞系 RPTC 分為對照組，H/R 組，H/R+ miR-216a NC組，H/R+miR-216a mimics組。3個H/R細胞組進行厭氧24 h 處理。H/R 模型復制：將3 個組的細胞放入厭氧盒中，加入兩包厭氧袋后進行厭氧，24 h取出細胞并更換無血清培養基進行常規培養，并轉染。

1.6實時熒光定量逆轉錄PCR（qRT-PCR）檢測提取各組RNA 后根據逆轉錄試劑盒合成互補DNA（cDNA），以cDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進行檢測，以U6為內參，算出各組細胞中miR-216a的相對表達量；以β-肌動蛋白（β-actin）為內參，算出各組細胞中KLF9、NF-κBp65、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、血管生長因子A（VEGF-A）、尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）的相對表達量。引物序列如下：KLF9正向引物：5′-GGACACCTGGAAGGATTATTG-3′，KLF9 反向引物：5′-CTGGATGGGTCGGTATTTG-3′；NF-κB p65 正向引物：5′-AACTGGGTGACATCTGCTTCT-3′，NF-κB p65 反向引物：5′-TCTTCAGGTTCTTGGCTTCC-3′；TNF-α 正向引物：5′-TCGTAGCAAACCACCAAGC-3′，TNF-α 反向引物：5′-AGCAATGACTCCAAAGTAGACC-3′；VEGF-A 正向引物：5′-AAATCCTGGAGCGTTCACTG-3′，VEGF-A 反向引物：5′-ACCGCCTTGGCTTGTCA-3′；uPA 正向引物：5′-GTCAAGACCAAAGGCAAACA-3′，uPA 反向引物：5′-GATTCCGAAAACGGCTCA-3′；β-actin 正向引物：5′-AGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，β-actin 反向引物：5′-ATACCCAGGAAGGAAGGCT-3′；U6 正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6 反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-216a正向引物：5′-CACAGTGGTCTCTGGGATTATG-3′，miR-216a反向引物：康為世紀的通用引物。

1.7統計學方法所有數據均用SPSS 17.0統計分析。定量結果采用xˉ±s表示。多組之間定量數值比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

2 結果

2.1雙熒光素酶報告基因檢測實驗構建熒光素酶報告載體，轉染293T 細胞，熒光分光光度計測定熒光值，結果顯示，miR-216a mimics+KLF9 野生型共轉染組的熒光素酶活性（0.67±0.02）顯著低于KLF9 野生型組（4.34±0.01）、miR-216a NC+KLF9 野生型共轉染組（4.45±0.21）的熒光素酶活性（F＝28.92，P＜0.001）。

2.2 miR-216a對H/R誘導的大鼠腎臟近端腎小管上皮細胞系RPTC中miR-216a、KLF9表達量的影響與對照組比較，H/R 組及H/R+miR-216aNC 組中miR-216a 表達量下調（P＜0.05），KLF9 表達量上調（P＜0.05）；與H/R 組及H/R+miR-216aNC 組比較，H/R+miR-216a mimics 組中 miR-216a 表達量上調（P＜0.05），KLF9 表達量下調（P＜0.05）。說明miR-216a轉染成功，同時能夠靶向下調KLF9表達。見表1。

表1 miR-216a對H/R誘導的大鼠腎臟近端腎小管上皮細胞系RPTC中miR-216a、Kruppel樣轉錄因子9（KLF9）表達量的影響/xˉ± s

2.3 miR-216a對H/R誘導的大鼠腎臟近端腎小管上皮細胞系RPTC中NF-κB p65、TNF-α、VEGF-A、uPA mRNA表達量的影響與對照組比較，H/R組及H/R+miR-216aNC組中NF-κB p65、TNF-α、VEGFA、uPA mRNA表達量上調（P＜0.05）；與H/R組及H/R+miR-216aNC 組比較，H/R+miR-216a mimics 組中NF-κB p65、TNF-α、VEGF-A、uPA mRNA 表達量下調（P＜0.05）。見表2。

表2 miR-216a對H/R誘導的大鼠腎臟近端腎小管上皮細胞系RPTC中核因子-κB（NF-κB）p65、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、血管生長因子A（VEGF-A）、尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）mRNA表達量的影響/xˉ±s

3 討論

miR-216a 是一種定位于染色體Zp16.1 的小分子非編碼RNA，是miR-216家族的一員，具有胰腺特異性。研究已經證實miR-216a 在肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌等惡性腫瘤組織中低表達，并與腫瘤的發生發展密切相關［11-13］。另有報道表明急性胰腺炎SD 大鼠在胰腺損傷12 h后發現血清中miR-216a 表達量顯著增高，在24 h到達峰值，72 h后表達量有所降低，進而miR-216a被認為是急性胰腺炎所引起的胰腺損傷的標志物［7］。miR-216a 通過靶向調控Y-框結合蛋白1（Ybx1）表達在糖尿病腎病的發病機制中起著重要作用［7，14］。提示miR-216a在急性腎損傷的發生過程中也起著重要作用。同時miRNA 在細胞生物學行為中的作用基本是通過其與靶基因的結合實現的。KLF9是一類高度保守的轉錄因子，有17個家族成員，且家族成員典型結構特征是有一個高度保守的DNA 結合結構域。根據其結構相似性及功能上的差異，此家族分為3個亞族，亞族1是典型的轉錄抑制子，包括KLF3、8、12；亞族2是轉錄激活子，包括KLF1、2、4、6、7；亞族3 根據其在細胞分化的不同階段被當成激活子或者轉錄子，包括KLF9、10、11、13、14、16。其中KLF9 又被稱為基礎轉錄序列結合蛋白1，能夠通過促進過氧化物酶體活化受體γ，進而調控糖異生過程。研究也顯示KLF9 是糖尿病腎病發生的標志物［10］。本研究通過miRDB 軟件檢索出 KLF9 基因 3'-UTR 與 miRNA 的結合位點，并采用熒光素酶報告基因證實KLF9 是miR-216a 下游靶基因。本研究接著用H/R 誘導腎小管上皮細胞復制體外急性腎損傷細胞模型，接著轉染miR-216a，qRT-PCR 實驗結果表明H/R 誘導后miR-216a表達量下調，KLF9表達量上調，轉染miR-216a mimics 后，能夠顯著的下調KLF9 表達，提示miR-216a過表達能通過負性調控KLF9表達進而抑制急性腎損傷。

腎缺血再灌注損傷是急性腎損傷的重要原因，缺血引起腎近端小管產生炎癥反應，激活包括NF-κB在內的炎癥信號通路［3，15］。NF-κB信號通路是一條不僅參與免疫細胞活化、增殖、分化及細胞應激反應的信號通路，同時也參與了多種炎癥介質的轉導過程。經典的NF-κB 包括2 個亞基，分別為p50、p65，也是其活性形式。NF-κB 在未受刺激時候，能夠與其上游信號蛋白IκB（NF-κB的抑制蛋白）結合并位于細胞質內，在受到外界刺激時，此復合物被降解，NF-κB轉位進入細胞核，調控相關靶基因的轉錄。研究顯示NF-κB 啟動子位點上含有多種炎性因子結合的位點，能夠調控多種炎性因子的表達［3，15-16］。且研究也顯示在急性腎損傷過程中NF-κB p65、TNF-α、VEGF-A、uPA mRNA 表達量上調，通過抑制NF-κB信號通路的活性，能一定程度抑制這些炎性因子的釋放，緩解急性腎損傷程度［17-19］。本研究結果表明miR-216a mimics能顯著降低NF-κB p65 mRNA 表達，同時還能顯著下調 TNF-α、VEGF-A、uPA mRNA 表達量，進而抑制急性腎損傷引起的炎癥反應。

綜上所述，KLF9是miR-216a下游靶基因，miR-216a 過表達能夠通過靶向下調KLF9 表達，并阻斷NF-κB 信號通路，進而下調TNF-α、VEGF-A、uPA mRNA 表達，最終抑制H/R 誘導的腎小管上皮細胞急性腎損傷。