過敏性哮喘誘導痰中高遷移率族蛋白B1、晚期糖基化終產物受體表達與血清總免疫球蛋白E 水平的相關性

馬敬斌，王道方

作者單位：聊城市第二人民醫院兒科，山東 聊城252600

過敏性哮喘是反復接觸過敏原后，產生主要由免疫球蛋白E（IgE）介導的一種變態反應性呼吸道炎性疾病，發病表現為咳嗽、喘鳴及呼吸困難［1-2］。高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是一種具有免疫調節功能的重要細胞因子，且有組織修復的功能，許多研究表明拮抗HMGB1 活性可緩解哮喘，推測HMGB1影響哮喘慢性氣道炎癥發病過程［3-4］。晚期糖基化終產物受體（RAGE）是HMGB1 重要受體之一，兩者結合后激活細胞內信號傳導途徑，導致病理損傷發生，影響關節炎、動脈粥樣硬化等炎性疾病的發病過程［5］。IgE 屬于人體五大免疫球蛋白之一，可促發、推進Ⅰ型變態反應［6］。當變應原進入易感者體內，大量IgE吸附于嗜酸性粒細胞表面，使機體處于致敏狀態，引起哮喘［7］。因此，檢測血清總IgE水平對于Ⅰ型變態反應和過敏原的確定很有價值。但目前關于過敏性哮喘病兒誘導痰中HMGB1、RAGE與血清總IgE水平相關性的研究較少。

因此，本研究通過檢測過敏性哮喘病兒誘導痰中HMGB1、RAGE與血清總IgE水平，探討各指標之間的相關性，從而為臨床上提供過敏性哮喘的診斷指標，對評價其早期危險性有重要意義。

1 資料與方法

1.1一般資料選取 2015 年 4 月至 2018 年 9 月因過敏性哮喘于聊城市第二人民醫院免疫專科門診及病房接受治療的150 例病兒為研究對象，其中2例病兒誘導痰失敗，最后納入148例病兒（哮喘組），其中男83 例，女65 例；年齡（7.63±4.01）歲，范圍為3～12歲；同期選取136例健康體檢兒童作為對照組，其中男71例，女65例；年齡（7.72±4.23）歲，范圍為3～13 歲。兩組性別（χ2＝0.287，P＞0.05）、年齡（t＝0.184，P＞0.05）等一般資料比較差異無統計學意義。

納入標準：①符合過敏性哮喘診斷標準［8］并排除其他呼吸系統疾病者；②入組前4 周無全身糖皮質激素應用者；③入組前1周未使用抗白三烯、抗組胺類藥物者；④年齡范圍為3～13歲。排除標準：①有風濕類疾病、其它心肺疾病及精神異常者；②有糖皮質激素和β2受體激動劑過敏史者；③入組前4 周有呼吸道感染者。本研究病人或其近親屬知情同意，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2主要試劑與儀器IgE 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒，購自上海凱博生物科技有限公司；HMGB1 ELISA試劑盒（生產批號180214），購自深圳市科潤達生物工程有限公司；RAGE ELISA 試劑盒（生產批號180425），購自北京綠源伯德生物科技有限公司；二硫蘇糖醇（DTT）溶液，購自南京森貝伽生物科技有限公司。HB7501 型五分類全自動血細胞分析儀，購自濟南童鑫生物科技公司；CHESTAC-8900型肺功能儀，購自北京西化儀科技有限公司。

1.3研究方法

1.3.1 樣品采集及保存 血清采集抽取兩組兒童清晨空腹靜脈血，其中一管加入乙二胺四乙酸二鉀抗凝；另一管3 000 r/min離心15 min后收集血清，置于-80 ℃保存待測。

誘導痰采集給予兩組兒童4.5%高滲鹽水氧化射流霧化吸入，鼻腔內分泌物完成清除后進行漱口、吞水，充分清潔鼻腔及口腔后，在家長配合下讓兩組兒童進行重復深咳嗽獲得至少1 g痰液，部分做中性粒細胞檢測，另一部分加入2 倍體積0.1%DTT溶液，震蕩混勻15 s，37 ℃恒溫水浴鍋中震蕩15 min，3 000 r/min 離心 15 min 后收集上清，置于-80 ℃保存待測。

1.3.2 ELISA 法檢測誘導痰中 HMGB1、RAGE 及血清總IgE水平 -80 ℃中取出誘導痰和血清，ELISA法檢測兩組兒童誘導痰中HMGB1、RAGE及血清總IgE水平，檢測方法按照試劑盒說明書進行。

1.3.3 檢測肺功能指標、粒細胞水平 肺功能指標檢測采用肺功能儀檢測兩組兒童的肺通氣功能，主要檢測指標：第一秒用力呼氣量（FEV1）、用力肺活量（FVC）、最大呼氣峰流速（PEF）。誘導痰中性粒細胞水平檢測誘導痰采集后不經稀釋處理制成痰標本，痰涂片可見較多柱狀上皮細胞和巨噬細胞且鱗片上皮細胞占有核細胞比例＜0.2 的標本為合格。選取少量痰標本進行涂片，風干后做瑞氏染色，顯微鏡進行分類計數，計算中性粒細胞百分比。血清嗜酸粒細胞檢測取抗凝處理的血，使用五分類全自動血細胞分析儀進行分類計數，計算嗜酸粒細胞百分比。

表2 過敏性哮喘病兒148例與健康兒童136例肺功能指標、粒細胞水平比較/（%，xˉ±s）

1.4統計學方法利用SPSS 23.0對數據進行統計學分析，計量資料以xˉ±s表示，兩組比較行t檢驗；采用Pearson法分析兩組HMGB1、RAGE、IgE與肺功能指標、粒細胞相關性，分析哮喘組HMGB1、RAGE與IgE水平相關性。logistic 回歸分析影響過敏性哮喘的因素。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1兩組誘導痰中HMGB1、RAGE表達及血清總IgE水平比較哮喘組誘導痰中HMGB1、RAGE 表達及血清總IgE 水平均顯著高于對照組（P＜0.05），見表1。

表1 過敏性哮喘病兒148例與健康兒童136例誘導痰中HMGB1、RAGE表達及血清總IgE水平比較/xˉ±s

2.2兩組肺功能指標、粒細胞水平比較哮喘組FEV1、FVC、PEF水平均顯著低于對照組（P＜0.05），中性粒細胞、嗜酸粒細胞水平顯著高于對照組（P＜0.05），見表2。

2.3過敏性哮喘病兒HMGB1、RAGE、IgE與肺功能指標、粒細胞水平相關性Pearson法分析結果顯示，兩組HMGB1、RAGE、IgE 與FEV1、FVC、PEF 水平均呈現負相關（P＜0.05）。與中性粒細胞、嗜酸粒細胞水平均呈現正相關（P＜0.05）。見表3。

2.4過敏性哮喘病兒誘導痰中HMGB1、RAGE表達與血清總IgE水平相關性Pearson 法分析結果顯示，過敏性哮喘病兒誘導痰中HMGB1、RAGE 表達與血清總IgE 水平均呈現正相關（r＝0.454、0.522，均P＜0.05）。

2.5影響過敏性哮喘的多因素分析將是否發生過敏性哮喘為因變量，以HMGB1、RAGE、IgE等為自變量進行logistic 回歸分析，結果顯示HMGB1、RAGE、IgE、嗜酸性粒細胞是影響過敏性哮喘發生的危險因素。見表4。

表3 過敏性哮喘病兒HMGB1、RAGE、IgE水平與肺功能指標、粒細胞水平相關性

表4 影響過敏性哮喘的多因素分析

3 討論

兒童過敏性哮喘長期反復發作可并發慢性支氣管炎、肺間質纖維化等［9-10］。過敏性哮喘病人發病機制主要是其體內存在多種細菌、病毒的特異性IgE，吸入相應抗原時即可激發哮喘［11］。

HMGB1是一種晚期炎癥介質，廣泛分布于細胞核內外，能參與氧化應激反應、刺激促炎因子產生、促進炎癥細胞活化，目前已被證實在類風濕性關節炎、慢性阻塞性肺疾病、慢性心力衰竭等多種疾病發病過程中發揮作用［12-13］。RAGE 是 HMGB1 受體之一，與HMGB1結合后可趨化炎癥細胞募集［14］。吳小進等［15］表明HMGB1能劑量依賴性誘導RAGE蛋白的表達，支氣管上皮細胞中HMGB1誘導的炎癥反應通過RAGE/c-Jun氨基端激酶（JNK）/核因子-κB（NF-κB）信號通路介導。本研究提示過敏性哮喘病兒誘導痰中HMGB1、RAGE 表達水平高于健康兒童，分析HMGB1、RAGE 結合后，觸發信號通路，促進NF-κB活化，促使炎癥反應進行，參與過敏性哮喘發生過程。

IgE是人體五大免疫球蛋白之一，正常情況下IgE低表達［16］。陳丹君等［17］指出哮喘病兒血清中25-羥維生素D3水平降低，IgE水平增加，且與病情嚴重程度呈正相關。本研究提示過敏性哮喘病兒血清中總IgE水平高于健康兒童，分析機體內B淋巴細胞合成IgE后，激活嗜酸性粒細胞、肥大細胞，釋放炎性介質使病人出現炎癥反應、引起平滑肌收縮、毛細血管擴張，最終導致哮喘。

FEV1 及PEF 是檢測大小氣道氣流受限的肺功能常用指標，能反映大氣道的阻塞情況［18］。嗜酸粒細胞釋放多種蛋白造成氣道上皮細胞損傷，最終導致哮喘。許多研究發現部分重癥哮喘或難治性哮喘病人表現為中性粒細胞性氣道炎癥，中性粒細胞與炎癥介質共同作用影響哮喘的發生［19］。本研究提示過敏性哮喘病兒FEV1、FVC、PEF 水平低于健康兒童，中性粒細胞、嗜酸粒細胞水平高于正常兒童，過敏性哮喘病兒肺功能受損。

進一步研究發現過敏性哮喘病兒HMGB1、RAGE、IgE 與FEV1、FVC、PEF 水平均呈現負相關，與中性粒細胞、嗜酸粒細胞水平均呈現正相關；且誘導痰中HMGB1、RAGE 表達與血清總IgE 水平均呈現正相關。logistic 回歸分析結果顯示HMGB1、RAGE、IgE、嗜酸性粒細胞是影響過敏性哮喘發生的危險因素。提示 HMGB1、RAGE、IgE 可能與FEV1、FVC、PEF、粒細胞共同作用，影響過敏性哮喘發生。進一步提示臨床上應密切關注各指標水平的變化，尤其是HMGB1、RAGE、IgE、中性粒細胞，及時預防和治療。