晉北散養邊雞群ALV-p27攜帶率及ALV-A/B與ALV-J亞群的ELISA檢測

馬 馨，劉一飛，王志宇，魏清宇，葉紅心，李培峰

（1.山西農業大學（山西省農業科學院）動物科學學院，山西太原030032；2.山西農業大學（山西省農業科學院）動物醫學學院，山西太原030032）

禽白血病（Avian leukosis，AL）是由禽白血病病毒（Avian leukosis Virus，ALV）和肉瘤病毒群病毒（Avian Sarcoma Virus，ASV）引起的禽類多種腫瘤性疾病的統稱，在自然條件下以淋巴白血病最為常見，其他諸如紅細胞白血病、成髓細胞白血病、髓細胞瘤、纖維瘤等發生頻率較低。ALV可經垂直和水平傳播方式在禽類中傳播，可引起雞只罹患良性或惡性腫瘤，導致雞群產蛋率、肉品質、種蛋受精率和孵化率等生產、繁殖性能下降，同時造成嚴重的生長和免疫抑制，進而繼發感染其他細菌性與病毒性疾病[1-2]。依據ALV囊膜糖蛋白的抗原性差異、不同或相同亞群病毒的干擾實驗、在不同遺傳型雞胚成纖維細胞的宿主范圍和基因組結構性差異等特性，將其分類為11個亞群，即A～K亞群。其中，A、B、C、D、J和K亞群均屬于外源性白血病病毒，而E、F、G、H和I亞群則屬于內源性白血病病毒[3]。目前，我國禽類的ALV感染主要以J亞群為主，同時也有ALV-A/B的局部流行[4-5]。J亞群是由外源性ALV和內源性ALV重組而成，主要引起雞的傳染性致骨髓細胞瘤疾病或成髓性白血病[6]，而A、B亞群則主要誘發雞的淋巴細胞白血病[7]。在國務院頒布的《我國中長期動物疫病防治規劃（2010—2020年）》中，把禽白血病列為必須凈化的疫病之一。得益于我國禽白血病檢疫和凈化措施的嚴格執行，國內白羽肉雞和蛋用型雞的ALV攜帶率得到有效控制。尤其近幾年，鮮有典型病例的暴發，成為我國首個不使用疫苗僅通過種源凈化而被有效防控的禽類傳染病。然而，在我國某些固有的地方品種雞群中，禽白血病還不時有散發流行，尤其在農戶混養、散養雞群中仍可能存在外源ALV感染的隱患。因此，在重視集約化養雞場白血病凈化的同時，仍須對農戶散養雞群開展ALV檢測和凈化。

為此，山西省農業科學院畜牧研究所邊雞課題組對2018—2019年于晉北地區農戶散養邊雞群中采集到的92份蛋清和血清樣品進行了ALV-p27抗原、ALV-A/B及ALV-J抗體的ELISA檢測，旨在為該區域散養邊雞群ALV的防控和凈化提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

2018—2019年于山西晉北地區農戶散養邊雞群中采集20周齡商品代蛋雞開產初期種蛋蛋清12份，1周齡育雛期商品代蛋雞血液樣本80份。

1.2 主要試劑

ALV-p27抗原、ALV-A/B及ALV-J抗體檢測試劑盒均購自美國IDEXX公司。DMEM細胞培養液、胎牛血清（FBS）及胰酶消化液（0.25% ）均購自北京索萊寶生物科技有限公司。雞胚成纖維細胞系（DF-1）由山西農業大學動物生理學實驗室惠贈。

1.3 ALV抗原與ALV-A/B、ALV-J抗體檢測

1.3.1 種蛋ALV-p27抗原檢測 從種蛋中吸取蛋清0.5 mL，-20℃反復凍融3次，恢復至室溫后靜置離心，吸取50μL蛋清液加入ELISA反應板中，按照試劑盒操作說明檢測ALV-p27抗原。

1.3.2 血清ALV-p27抗原檢測 肝素鈉采血管采集的雞血凝固后以4 000 r/min離心10 min，將血清分離，于-20℃保存備用。檢測時取50μL血清加至ELISA反應板中，按照試劑盒操作說明檢測ALV-p27抗原。

1.3.3 ALV-A/B與ALV-J抗體檢測 用稀釋液將血清樣品稀釋為1∶500，參照ALV-A/B和ALV-J抗體檢測試劑盒操作對ALV-A/B和ALV-J抗體進行檢測。

1.3.4 DF-1細胞培養液ALV-p27抗原檢測 將ALV-p27抗原ELISA檢測陽性的蛋清和陽性血清對應抗凝血樣品接種于單層DF-1細胞，同時設無ALV-p27抗原的DF-1陰性對照。37℃5% CO2孵育2 h，更換含3% FBS、1% 氨芐青霉素的DMEM持續培養7 d，培養結束后反復凍融3次，取細胞培養液經ELISA檢測ALV-p27抗原。

2 結果與分析

2.1 ALV-p27抗原檢測結果

從表1可以看出，受試的蛋雞蛋清和血清中ALV-p27抗原陽性率為9.78% 。ALV-A/B和ALV-J抗體陽性率分別為20.00% 和6.25% ，ALV-A/B和ALV-J亞群間共感染陽性率為0。結果表明，受試的蛋雞群存在外源性禽白血病病毒感染，不存在ALV-A/B和ALV-J 2種或3種亞群共感染情況。

表1 ALV-p27抗原和ALV-A/B、ALV-J抗體檢測

2.2 DF-1細胞培養物ALV-p27抗原檢測

將DF-1細胞培養7 d后的上清液用ELISA試劑盒檢測ALV-p27抗原。結果顯示，9份受試樣品的細胞培養液中均呈ALV-p27抗原陽性，確定此9份樣品來源的邊雞個體均感染外源性ALV。

3 結論與討論

目前，有關ALV及其亞群的檢測方法通常包括酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、間接免疫熒光檢測法（IFA）、病毒中和試驗（NT）、瓊脂擴散試驗（AGP）、免疫組化（IHC）、PCR、RT-PCR、環介導等溫擴增技術（LAMP）、斑點分子雜交技術等[8-12]。為最大程度保證檢測的準確性，可同時結合血清學檢測和分子生物學檢測2種方法對ALV病原進行檢測。本試驗內容僅作為該雞場白血病凈化前期臨床調查，故只采用ELISA作為檢測手段。此外，有研究表明，應用ELISA對接種ALV的SPF雞肝臟、血清、骨髓組織的陽性檢出率均為100% ，而對泄殖腔棉拭子的陽性檢出率為70% ，提示可能由于泄殖腔棉拭子的病毒采集量太低，以至于出現假陰性現象，臨床檢測中應盡可能選擇血清作為檢測樣本[13]。

本試驗表明，供試邊雞群的ALV攜帶率為9.78% ；而張桂枝等[14]檢測的三黃雞泄殖腔棉拭子和蛋清ALV-p27陽性率分別為8.15% ～24.28% 和5.09% ～14.44% ；葛成等[15]檢測的太行雞、海蘭褐、壩上長尾雞蛋清的ALV-p27攜帶率分別為8.38% ～21.35% 、1.12% ～1.43% 、10.91% 。本研究邊雞群ALV-A/B抗體陽性率為20.00% ，張桂枝等[14，16]檢測的三黃雞血清ALV-A/B抗體陽性率為6.25% ～33.70% ，綠殼蛋雞為30.43% ，青腳麻雞為18.48% ，固始雞為28.26% 。本研究邊雞群ALV-J抗體陽性率為6.25% ，張桂枝等[14，16]檢測的三黃雞血清ALV-J抗體陽性率為2.17% ～22.83% ，綠殼蛋雞為16.85% ，青腳麻雞為6.52% ，固始雞為17.39% 。由于本試驗受試樣本數量相對較少，與上述研究中蛋雞ALV的檢出率不具有統計學橫向比較意義，僅作為該蛋雞場ALV的凈化參考。錢晨[17]研究了不同品種雞ALV-A/B和ALV-J的感染情況，發現ALV-A/B、ALV-J感染率最高的依次為黃羽肉雞、麻雞，且這2種肉用或肉蛋兼用型雞的ALV-J顯著高于蛋用型雞。需要指出的是，通常情況下，雞染色體基因組中存在的內源性ALV-E cDNA在一定條件下會表達出完整的病毒粒子或僅表達p27抗原蛋白，從而導致基于ALV-p27抗原的ELISA檢測陽性率增高[18]。但是，本試驗結果中卻出現了ALV-A/B抗體陽性數遠高于ALV-p27抗原陽性數的現象。通常認為，先天性感染的內源性ALV不會激發免疫系統產生抗體[12]，但也有研究表明，通過大腸桿菌表達的ALV-E gp85蛋白（膜表面蛋白SU）免疫雞后，部分雞血清中穩定產生了與ALV-A/B發生交叉反應的抗體，可用ALV-A/B抗體ELISA試劑盒檢出[19]。據此，筆者推測本試驗中ALV-A/B抗體陽性數高于ALV-p27抗原陽性數，可能是因內源性ALV-E產生了與外源性ALV相應的抗體交叉反應所致。該雞場邊雞群中是否存在ALV-E的完整傳染性粒子，是否存在gp85（ALV主要抗原表位）的表達，還需在SPF雞胚來源的15B1 CEF細胞上進行病毒的傳代分離及細胞培養上清液和基因組中gp85基因的PCR擴增予以佐證。

本研究表明，晉北農戶散養邊雞群感染的ALV亞群包括外源性ALV-A/B、ALV-J，未發現2種亞群病毒共感染個體存在。前期可依據ALV-p27抗原和ALV-J抗體檢測陽性結果淘汰ALV陽性帶毒雞。建議將ALV-A/B抗體檢測陽性雞血接種DF-1細胞進行病毒傳代分離、ELISA檢測后再行淘汰對應ALV-A/B陽性帶毒雞。