不同濃度黃連素對乳腺癌T47D細胞生物學特性的影響

劉亞江， 馮金華，鄒瓊燕，黃文超，李佳艷

作者單位： 423000 湖南省郴州市第一人民醫院醫療集團南院腫瘤ICU(劉亞江、黃文超、李佳艷)，健康管理中心(馮金華)；410011 長沙，中南大學湘雅二醫院甲乳外科(鄒瓊燕)

乳腺癌是女性易患的惡性腫瘤之一，不同國家乳腺癌患病人數也不相同，我國乳腺癌患者年齡逐漸下降，比其他國家女性早10～15年[1]。中國屬于發病率較低的國家，但是，近年來的增長速度卻持續升高[2]。調查數據顯示，我國東部城市的女性發病人數明顯多于其他地區[3]。乳腺癌的病因相當復雜，該病的發生與遺傳、環境等多種原因有關[4]，已引起臨床及科研人員高度關注，正逐步加深治療乳腺癌的相關研究。雖然手術治療及術后的化、放療發展迅速，對乳腺癌患者作用明顯，但仍不能阻礙癌細胞的轉移[5]。乳腺癌的轉移、復發嚴重延緩了患者的康復時間，給治療增加了很多困難。因此，尋求綜合、有效的治療方案是當今醫學研究的熱點[6]。黃連素是黃連抗菌的主要成分，該藥物對臨床常見疾病有一定治療效果[7-8]。實驗研究顯示，黃連素對常見癌癥存在一定抑制作用，但黃連素在乳腺癌中的作用及相關機制仍不清楚[9]。因此，現對乳腺癌細胞株(T47D細胞)凋亡、增殖、侵襲、遷移情況進行研究，并觀察不同濃度黃連素對T47D細胞生物學特性的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)T47D細胞：在ATCC細胞庫購買乳腺癌細胞株(T47D細胞)，隨機分為3組，乳腺癌組(BC組)單純T47D細胞不做其他處理，正常培養；低濃度組(LC組)將T47D細胞與10 μmol/L黃連素溶液混合培養；高濃度組(HC組)將T47D細胞與30 μmol/L黃連素溶液混合培養。(2)試藥試劑：黃連素(上海曙燦實業公司)，胎牛血清CCK-8 試劑盒(北京杰輝博高生物公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)(紹興市精源儀化貿易中心)。(3)儀器：恒溫搖床(成都蘇凈器材公司，型號 CHA-S型)，離心機(上海繼譜電子科技有限公司，型號 LGZ800)，熒光顯微鏡(上海萬衡精密儀器有限公司，型號 XSP-BM22AY)，讀板器(深圳瑪雅電玩科技有限公司，型號 VL0000D0)，Transwell小室(武漢弗凡科技有限責任公司,型號PIHT12R48)，Guava流式細胞儀(南京兆坤儀器有限公司，型號Guava)。

1.2 細胞培養 2019年2—8月在郴州市第一人民醫院進行實驗。將T47D細胞在含有胎牛血清的DMEM培育液中培養。當細胞數量增長至80%～90%時，胰蛋白酶消化、離心、收集、重懸并培養T47D細胞。LC組、HC組分別將T47D細胞與10 μmol/L、30 μmol/L的黃連素溶液混合培養，48 h后用于檢測實驗。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 TUNEL檢測T47D細胞凋亡：將蓋玻片置于6孔板內，在6孔板中種入T47D細胞培養過夜，使T47D細胞生長占70%～80%培養皿，進行TUNEL染色，然后用20 μg/ml蛋白酶K孵育，用TdT/dUTP反應混合物在37℃孵育1 h進行DNA片段標記，然后使用PBS洗3次，用含有5%正常山羊血清的封閉緩沖液封閉1 h，將切片在封閉緩沖液中與兔抗大鼠SP1抗體(1∶1 000)一起孵育1 h，在避光、室溫條件下孵二抗(1∶200)40 min，進一步沖洗后，用蓋玻片覆蓋切片，切片中加Vectashield Hard Set 封固涂片樣本，標記反應，于熒光顯微鏡下觀察染色結果并拍照。

1.3.2 流式細胞儀檢測T47D細胞凋亡：增加培養液調整T47D細胞密度為1.2×106/L，接種于6孔板中，處理12 h,培養箱中孵育24 h，采用不含EDTA的消化液消化，1 000 r/min離心5 min并收集細胞，4℃預冷的PBS洗滌細胞2次，棄去上清液，各組分別加入400 μl預冷的1×結合緩沖液，分別加入5 μl Annexin V-FITC和LPI溶液，混勻細胞，避光孵育15 min后，1 h內上機檢測。采用FC500流式細胞儀進行分析。

1.3.3 CCK-8法檢測T47D細胞增殖： 取出轉染后的T47D細胞，稀釋為1×105/ml，置于細胞培養箱中孵育24 h后取出，取培養好的T47D細胞平鋪到16孔板中培養。待細胞增長至一定數量后，加入CCK-8試劑10 μl。37℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養4 h后，于全自動酶標儀(波長=450 nm)下檢測各孔吸光度 A 值(A=各孔的OD值-調零孔的OD值 )。

1.3.4 細胞劃痕法測定T47D細胞的遷移能力： 取一瓶長滿的以對數生長的T47D細胞，用含EDTA的0.25%胰酶消化并收集細胞，加入完全培養基終止消化后，將細胞懸液移至15 ml離心管中離心，速度1 000 r/min，離心5 min，棄上清液，加入完全培養基5 ml，用1 ml移液槍充分吹打完全后，進行細胞計數，放入CO2培養箱中培養，第2天進行模擬罐法負壓干預，在長滿單層T47D細胞的情況下用細胞刮刀垂直培養袋底劃痕(細胞刮刀的劃痕寬度為0.5 mm)，用PBS洗細胞3次，洗去劃下的細胞，加入無血清培養基并放入模擬罐法負壓裝置中，之后移至37 ℃、5%CO2培養箱培養、24 h后拍照(記為24 h)。

1.3.5 Transwell 檢測T47D細胞侵襲： 取出轉染后的T47D細胞，稀釋為1×105/ml，在血清培養基中培養12 h。準備Transwell小室，上室鋪ECM膠，下室加500 μl含10%血清培養基，靜置4 h，吸出液體，殘留液風干。取200 μl培養好的細胞接種在遷移室中,24 h后，取出細胞，乙醇固定，結晶紫溶液染色，顯微鏡下觀察。

2 結 果

2.1 各組TUNEL法檢測T47D細胞凋亡數量比較 鏡下觀察發現，BC組T47D細胞凋亡數量最少，HC組細胞凋亡數量最多，BC組細胞凋亡數低于LC組(t=7.111,P<0.01)，LC組凋亡數低于HC組(t=16.852，P<0.01)，3組細胞凋亡數量比較差異有統計學意義(F=336.254，P<0.01)，見圖1。

2.2 各組流式細胞儀檢測T47D細胞調亡率比較 HC組T47D細胞凋亡數量最多，凋亡率為(61.35±6.38)%，LC組為(26.97±3.75)%，BC組為(16.57±2.53)%。BC組細胞凋亡率低于LC組(t=7.275,P<0.01)，LC組凋亡率低于HC組(t=14.697，P<0.01)，3組細胞凋亡率差異有統計學意義(F=264.600，P<0.01)，見圖2。

2.3 各組CCK-8法檢測T47D細胞增殖比較 T47D細胞的增殖數量以OD值表示，HC組(0.45±0.06)低于LC組(0.72±0.08)(t=8.538，P<0.01)低于BC組(1.12±0.10)(t=9.877，P<0.01),3組細胞增殖數量比較差異有統計學意義(F=170.582，P<0.01)。

2.4 各組細胞劃痕法檢測T47D細胞遷移能力比較 0 h時3組T47D細胞均無遷移，24 h時HC組T47D細胞遷移面積最小為(358.4±37.5)pixel2，無細胞區域寬度最大；LC組T47D細胞遷移面積(474.9±46.8)pixel2顯著高于HC組細胞(t=6.143，P<0.01)，BC組T47D細胞遷移面積(543.6±55.7)pixel2顯著高于LC組細胞(t=2.986，P=0.007)，3組細胞遷移面積比較差異有統計學意義(F=39.25，P<0.01)，見圖3。

2.5 各組Transwell法檢測T47D細胞侵襲能力比較 HC組T47D細胞侵襲能力較差，顯微鏡下細胞侵襲數量為(11.22±0.84)個；LC組T47D細胞侵襲數量為(25.36±1.41)個；BC組T47D細胞侵襲數量為(46.75±3.18)個，HC組細胞侵襲數量少于LC組(t=27.246，P<0.01)，BC組細胞侵襲數量高于LC組(t=19.453,P<0.01)，3組細胞侵襲能力比較差異有統計學意義(F=754.263，P<0.01)，見圖4。

3 討 論

乳腺癌發病率已位居婦科癌癥首位。近年來，我國在治療乳腺癌方面獲得了較多的成就，手術、化療、內分泌及靶向治療方式，在減輕患者痛苦的基礎上，也提高了部分患者5～10年生存率，但癌細胞轉移情況時有發生，發生率也同樣居高不下[10]。隨著臨床工作者的不斷探索，除常規手術之外的多種治療手段也得到了應用，但早期乳腺癌的治療方法仍局限于手術治療，放療加化療的手術患者生存率也開始小幅度提升[11]，但治愈率仍較低，因此，急需尋找更好的藥物來治療乳腺癌。研究顯示，黃連素具有氮三角的化學結構，在治療臨床常見疾病中有較顯著的效果[12]。近年來發現，黃連素的藥理作用在治療癌癥方面也較為顯著，同時，黃連素具有高安全性、有效性和低成本的特點，可廣泛應用于臨床中癌癥的治療[13]。

研究發現，顯著增加癌細胞中黃連素的含量能抑制卵巢癌細胞的生長。卵巢癌細胞的生長、發育與黃連素有密切關系，并在抑制癌細胞生長、遷移的過程中占主導地位[14-15]。本研究表明，BC組T47D細胞凋亡率最少，HC組T47D細胞凋亡率最多，HC組T47D細胞凋亡率顯著多于LC組，LC組T47D細胞凋亡率顯著多于BC組。HC組細胞增殖OD值顯著低于LC組，LC組T47D細胞的增殖OD顯著低于BC組。HC組T47D細胞侵襲、遷移數量顯著低于LC組，LC組T47D細胞侵襲、遷移數量顯著低于BC組。大量研究發現，黃連素在食管癌的發展過程中有抑制癌細胞的作用，其高表達還能抑制卵巢癌的增殖和轉移能力。黃連素在治療人體多種系統和器官惡性腫瘤中效果顯著，高濃度黃連素可抑制食管癌細胞的生物學行為，發揮抑癌基因的作用[16-17]。研究表明，增加細胞中黃連素的含量能顯著影響細胞的活性，與癌細胞的惡性度關系顯著，能使其惡性度顯著下降，這與宮頸癌的治療率及復發率有顯著關系，說明在宮頸癌的發展過程中，黃連素的用藥濃度占關鍵作用[18]。報道顯示，在卵巢癌細胞中黃連素高表達能減緩癌細胞的擴散、增殖，且黃連素濃度與抑癌作用呈顯著相關性，即黃連素濃度越高，抑制作用越明顯，凋亡細胞數量越多[19-20]。以上多種研究表明，黃連素能夠抑制多種臨床常見腫瘤，延長患者生存時間，提高患者生存質量，可以通過調節黃連素在癌細胞中的表達含量來達到治療癌癥的目的，為乳腺癌的診斷和治療發展新方向。

綜上所述，黃連素對T47D細胞的生長存在抑制作用，且與黃連素的濃度呈正相關，即濃度越高，抑制效果越明顯。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

劉亞江、馮金華：提出選題及研究方向，設計研究方案，獲取數據，實施研究過程，論文撰寫；鄒瓊燕、黃文超：補充研究方向，分析研究數據，修改論文；李佳艷：進行統計學分析，補充數據，論文終審