人類白細胞抗原-E、人類白細胞抗原-G 蛋白在早期宮頸癌及癌前病變中的表達與人乳頭瘤病毒感染的相關性研究

張莉，占超

1黃石市婦幼保健院婦女保健科，湖北 黃石 435000

2黃石市中醫醫院康復科，湖北 黃石 4350000

宮頸癌是一種婦科最常見的惡性腫瘤之一，中國家發病率僅次于乳腺癌，中國發病率位居世界前列且呈年輕化發展趨勢[1]，嚴重影響女性的生命健康?，F已證實，人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是多種宮頸疾病的主要危險因素，可能通過與宿主DNA結合而調節基因的轉錄水平，從而導致宮頸病變甚至誘發宮頸癌[2]。隨著醫療科研水平的提高，研究證實，宮頸癌的發生發展與機體的免疫應答密切相關[3]。人類白細胞化抗原（human lekocyte antigen，HLA）可識別外來抗原，在機體啟動免疫反應中發揮重要作用，其中HLA-E和HLA-G作為非經典的HLA-Ⅰ類分子，在多種腫瘤組織中表達上調[4]。研究發現，HLA-E和HLA-G可抑制多種免疫細胞的活性，使腫瘤逃避免疫監視，在腫瘤復發、轉移中發揮重要作用[5]。本研究采用免疫組化法分別檢測HLA-E、HLA-G在宮頸癌患者病理標本中的表達并檢測HPV感染狀態，探討二者與宮頸癌患者臨床特征的關系，并進一步分析其與HPV感染情況的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2018年2月黃石市婦幼保健院及黃石市中醫醫院收治的宮頸癌患者。納入標準：均經病理學檢查確診為宮頸癌；術前均未接受放化療等抗腫瘤治療；無其他腫瘤及免疫性疾病等病史；臨床資料完整。排除標準：月經期、妊娠期及哺乳期婦女；既往3天內曾有性生活史、婦科檢査、陰道沖洗或陰道內用藥。依據納入和排除標準，本研究共納入150例早期宮頸癌患者，年齡39～79歲，平均（46.26±12.23）歲，＜45歲60例，≥45歲90例；依據國際婦產科聯盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期標準：Ⅰa期76例，Ⅰb期74例；分化程度：高分化52例，中分化58例，低分化40例；腫瘤直徑：＜1 cm 70例，≥1 cm 80例。同期選取上皮內瘤病變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）患者和慢性宮頸炎患者。納入標準：篩查前無宮頸癌病史；受檢時處于非月經期；近3個月內無性激素使用史。排除標準：合并急性生殖道炎癥；既往存在宮頸錐切術或子宮切除術史；妊娠期女性。本研究共納入120例CIN患者和154例慢性宮頸炎患者。CIN組患者年齡32～75歲，平均（46.98±11.96）歲；CIN分級：CINⅠ38例，CINⅡ40例，CINⅢ46例。慢性宮頸炎組患者年齡30～72歲，平均（48.68±10.76）歲。取150例早期宮頸癌患者的宮頸癌組織，120例CIN患者的CIN組織，154例慢性宮頸炎患者的正常宮頸組織。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑 人宮頸癌細胞株HeLa（HPV16+）、C33a（HPV18+）、Cask（iHPV-）均購自海德創業（北京）生物科技有限公司，HPVl6 E6/E7特異性siRNA序列及陰性對照（negative control，NC）序列均由上海吉瑪制藥技術有限公司設計完成，E6及NC由上海吉碼制藥技術有限公司代為合成，鼠抗人HLA-E單克隆抗體、鼠抗人HLA-G單克隆抗體均購自北京奧維亞生物技術有限公司，HPV檢測試劑盒、通用型二抗試劑盒均購自美國Abcam公司，免疫組化試劑盒、二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，反轉錄試劑盒、蛋白質印跡（Western blot）試劑盒均購自美國sigma公司。

1.2.2 免疫組化法檢測HLA-E、HLA-G蛋白的表達情況 將收集的組織樣本固定包埋并切片，二甲苯和梯度乙醇脫蠟，檸檬酸鹽緩沖液修復，充分暴露抗原決定簇。3%的雙氧水室溫下浸泡10 min，封閉，分別加入稀釋好的一抗4℃孵育過夜，次日沖洗干凈，分別加入適量生物素標記的二抗室溫孵育30 min，清洗。加入適量DAB作用2～5 min，去離子水終止反應，蘇木素復染1.5～2.0 min，清洗后梯度乙醇脫水，二甲苯浸泡，干燥后用中性樹膠封片，鏡檢觀察并記錄實驗結果。結果判定：由兩名經驗豐富的病理醫師對病理切片進行盲評，光學顯微鏡下觀察制備好的切片，HLA-E、HLA-G蛋白主要定位于細胞質，細胞質呈棕黃色染色為陽性。每張切片隨機選取5個高倍視野，每個視野隨機計數200個細胞，根據染色強度和陽性細胞所占比例進行評分。染色強度評分：無著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。陽性細胞所占比例評分：無陽性細胞計0分，陽性細胞所占比例＜25%計1分，陽性細胞所占比例25%～50%計2分，陽性細胞所占比例51%～75%計3分，陽性細胞所占比例＞75%計4分。將染色強度評分和陽性細胞所占比例評分相加，≥3分為陽性，＜3分為陰性。

1.2.3 HPV 檢測及判定標準 采用一次性宮頸脫落細胞取樣器，在宮頸外口黏膜處取樣并置于無菌取樣管中，30 min內使用HPV檢測試劑盒對樣品進行檢測，以標本中HPV的表達值相對光單位/陽性標準品閾值（relative light units/cut off，RLU/CO）作為病毒負荷量，RLU/CO＜1判定為陰性，RLU/CO≥1為陽性，且陽性分為 1～100、101～1000和＞1000共3個病毒負荷量級別。

1.2.4 Western blot法檢測HLA-E、HLA-G蛋白的相對表達量 將人宮頸癌細胞株HeLa、轉染后48 h的HeLa-siE6和HeLa-NC細胞株，加入適量的放射免疫沉淀（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液裂解30 min，4℃情況下12 000 r/min離心10 min，收集上清，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒檢測蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液（loading buffer）混合，100℃水域變性5 min，然后加入至制備好的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠（5%濃縮膠，10%分離膠）上樣孔中，每孔25 μl，調整濃縮膠電壓為60 V，分離膠電壓為120 V，結束后取出凝膠，4℃轉膜1.5 h，采用5%脫脂奶粉封閉聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜2 h，加入轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、SMAD一抗，4℃過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物標記的羊抗兔IgG二抗，37℃孕育2 h后加入電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）顯影，采用自動凝膠成像系統采集圖像，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參，計算目的蛋白的相對表達量。

1.2.5 細胞轉染 調整人宮頸癌細胞株HeLa濃度至1×106/ml，取2 ml接種于6孔板中，培養過夜，采用Lipofectamine 2000將濃度均為100 nmol/L的siE6和NC轉染至人宮頸癌細胞株HeLa，得到HeLa-siE6及HeLa-NC細胞株，以未處理的HeLa細胞作為空白對照。

1.2.6 定量逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測E6mRNA 的相對表達量 將人宮頸癌細胞株HeLa、轉染后48 h的HeLa-siE6和HeLa-NC細胞株，加入1 ml Ezol裂解液，混勻。12 000 r/min離心10 min，去除上清液，加入Trizol與三氯甲烷震蕩混勻，12 000 r/min離心10 min，加入異丙醇，用移液器吹打均勻，12 000 r/min離心后，棄去上層清液，留下層絮狀沉淀，采用Trizol法提取各組細胞總RNA并進行反轉錄，按照PrimeScrip反轉錄試劑盒說明書反轉錄成cDNA，采用SYBR Premix ExTaq說明書配置PCR反應體系，反應條件：95℃預變性10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，40個循環；95℃ 5 s，60℃ 1 min，95℃ 30 s。以U6為內參，采用2-△△Ct計算E6mRNA的相對表達量。每個樣本獨立重復實驗3次。U6上游引物：5'-CCTGAGCAGGAACAGCTTGA-3'，下游引物：5'-CGTACGTAGTCGAACCGAGA-3'；E6上游引物：5'-CCATATCGCTGGATGACGAT-3'，下游引物：5'-GTG CAGGGTCCGAGGT-3'。

1.3 統計學方法

采用SPSS 16.0軟件對所有數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LDS-t檢驗，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HLA-E、HLA-G 蛋白陽性表達率的比較

隨病變程度的加重，HLA-E、HLA-G蛋白的陽性表達率均逐漸升高，其中宮頸癌組織中HLA-E、HLA-G蛋白的陽性表達率均高于CIN組織和慢性宮頸炎組織，CIN組織中HLA-E、HLA-G蛋白的陽性表達率均高于慢性宮頸炎組織，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同組織中HLA-E、HLA-G蛋白陽性表達情況的比較[n（%）]

2.2 HPV感染和病毒負荷量的比較

隨病變程度的加重HPV陽性率均逐漸升高，其中宮頸癌組織中HPV陽性率為89.33%（134/150），高于CIN組織和慢性宮頸炎組織的69.17%（83/120）和6.49%（10/154），CIN組織中HPV陽性率高于慢性宮頸炎組織，差異均有統計學意義（P＜0.05）。不同HPV病毒負荷量隨著病變程度的升高而增加（表2）。

表2 不同組織中HPV病毒負荷量

2.3 HLA-E、HLA-G 蛋白的表達與臨床特征的相關性分析

相關性分析顯示，HLA-E和HLA-G蛋白的表達與分化程度、CIN分級、TNM分期和HPV感染均呈正相關，與年齡、腫瘤直徑、淋巴結轉移情況無相關性，且HLA-E的表達與HLA-G呈正相關關系（r=0.745，P=0.021）。（表3）

表3 HLA-E、HLA-G蛋白的表達與臨床特征的相關性分析

2.4 不同HPV 感染狀態宮頸癌細胞中HLA-E、HLA-G 蛋白相對表達量的比較

Western blott法檢測不同HPV感染狀態的宮頸癌細胞中HLA-E、HLA-G的相對表達量，結果顯示，人宮頸癌Caski細胞中HLA-E、HLA-G的相對表達量均低于HeLa、C33a細胞，差異均有統計學意義（P＜0.05）；而人宮頸癌HeLa、C33a細胞中HLA-E、HLA-G的相對表達量的比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表4）

表4 不同HPV感染狀態宮頸癌細胞中HLA-E、HLA-G蛋白的相對表達量的比較（±s）

表4 不同HPV感染狀態宮頸癌細胞中HLA-E、HLA-G蛋白的相對表達量的比較（±s）

注：a與人宮頸癌HeLa細胞比較，P＜0.05；b與人宮頸癌C33a細胞比較，P＜0.05

細胞H e L a C 3 3 a C a s k i F值P值0.9 8±0.1 4 1.0 6±0.1 1 0.4 1±0.1 0 a b 1 5.6 2 3 0.0 0 0 1.0 2±0.0 8 1.0 4±0.0 9 0.5 2±0.0 8 a b 9.2 4 8 0.0 0 0 H L A-E蛋白H L A-G蛋白

2.5 不同人宮頸癌HeLa細胞中E6mRNA相對表達量的比較

HeLa-siE6細胞中E6mRNA的相對表達量為（0.28±0.02），明顯低于HeLa細胞的（0.95±0.09）和HeLa-NC細胞的（1.04±0.04），差異均有統計學意義（t=17.801、41.627，P＜0.01）。

2.6 沉默E6基因表達后不同HeLa細胞中HLAE、HLA-G 蛋白相對表達量的比較

人宮頸癌HeLa-siE6細胞中HLA-E、HLA-G蛋白的相對表達量，均明顯低于HeLa和HeLa-NC細胞，差異均有統計學意義（P＜0.01），但人宮頸癌HeLa、HeLa-NC細胞中的HLA-E、HLA-G蛋白的相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表5）

表5 不同HeLa細胞中HLA-E、HLA-G蛋白相對表達量的比較（±s）

表5 不同HeLa細胞中HLA-E、HLA-G蛋白相對表達量的比較（±s）

注：a與人宮頸癌HeLa細胞相比，P＜0.05；b與人宮頸癌HeLa-NC細胞相比，P＜0.05

細胞H e L a H e L a-N C H e L a-s i E 6 F值P值0.9 8±0.0 4 0.1 0±0.0 7 0.4 8±0.0 5 a b 1 1.6 5 2 0.0 0 0 0.0 9 7±0.0 3 1.0 2±0.1 2 0.5 0±0.0 6 a b 1 0.8 4 4 0.0 0 0 H L A-E蛋白H L A-G蛋白

3 討論

宮頸癌是導致女性病死的第二大惡性腫瘤，流行病學分析報告顯示，近年來，宮頸癌呈現高發且年輕化趨勢，宮頸癌的發展是從宮頸良性病變進展為宮頸上皮內瘤病變，再進展為惡性癌變，是一個動態并連續的過程[6]。因此，早期篩查并采取及時有效的控制措施進行干預是防止宮頸病變持續發展的關鍵。

近年來研究發現，機體的免疫功能與腫瘤的發生發展密切相關，HLA-G、HLA-E對免疫系統的影響已在多種腫瘤的得到證實，二者對樹突狀細胞、B細胞、自然殺傷細胞和T細胞具有相似的不良反應，可通過與細胞表面相應受體結合而發揮抑制作用；HLA-G、HLA-E還存在協同作用，可促進腫瘤細胞的免疫逃逸[7]。此外，HLA-G、HLA-E還可與某些細胞因子結合，使免疫細胞對腫瘤特異性抗原無應答反應。Cordeiro等[8]研究發現，HLA-G在宮頸病變CINⅢ組織中異常高表達，患者發生宮頸癌變的風險明顯增加。Kirana等[9]的研究結果顯示，HLA-G高表達宮頸癌患者的5年生存率明顯降低。Castelli等[10]結果發現，晚期直腸癌患者的HLA-E表達水平明顯高于早期患者。Gornalusse等[11]的研究顯示，HLA-G、HLA-E可對宮頸癌進行診斷和預后評估。本研究中也得到相似的結果，HLA-G、HLA-E蛋白的陽性表達率隨宮頸病變嚴重程度增加而升高，且相關性分析顯示，二者呈正相關關系。

宮頸癌是一種由多基因誘導而發生的疾病，被人們廣泛認知的是高危型HPV的持續感染，宮頸癌中E6和E7是HPV特異性癌蛋白，可通過干擾基因的表達，導致細胞周期紊亂、抑制凋亡，這種機制在原癌基因的激活中發揮了重要的作用，可導致機體免疫功能的失調[12]。多數女性在感染HPV后可誘發機體免疫反應，病毒被自然清除且病變消退，而少數感染不能及時清除的患者會導致疾病進展，甚至發生癌變。研究顯示，不同病變程度，機體HPV的負荷量呈動態變化[13]。寧雪朋等[14]對140例宮頸病變的患者進行研究，結果發現，宮頸癌患者的HPV陽性率明顯高于宮頸炎患者，且隨著癌變惡性程度的增加，HPV的陽性率也隨之增加。本研究中，宮頸癌組織中HPV陽性率為89.33%，高于慢性宮頸炎組織和CIN組織，且慢性宮頸炎組織中HPV陽性率低于CIN組組織，與既往研究結果相符。

在宮頸病變中，HLA-G、HLA-E和HPV均可導致機體免疫系統失調，相關性研究有利于理解宮頸癌的發生發展。有研究指出，多種細胞因子在HLA-G、HLA-E表達通路和HPV致癌通路中同時發揮作用[15]。Swets等[16]研究表明，HPV E6蛋白與p53相互結合后可抑制腫瘤細胞的凋亡，而p53可調節HLA-G的表達，參與腫瘤的進展。研究發現，HLA-E 可促進核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）靶基因cIAP1、cIAP2的表達，而HPV18 E6蛋白是介導NF-κB磷酸化的重要因子，發揮NF-κB的抗凋亡作用[17]。本研究結果顯示，HLA-G、HLA-E的相對表達量與HPV陽性率均呈正相關。為進一步研究HLA-G、HLA-E與HPV感染的相關性，本研究分析了不同HPV感染狀態的宮頸癌細胞中這兩種抗原的相對表達量，結果顯示，HLA-G、HLA-E在感染HPV的細胞中的相對表達量均明顯升高，且與病毒感染類型無關。在HeLa（HPV16+）細胞中，沉默E6基因表達后，HLA-E、HLA-G蛋白的相對表達量均明顯下降，再次證明HLA-G、HLA-E的表達與HPV感染的相關性，同時也說明HPV感染導致的HLA-G、HLA-E表達水平上升可能是腫瘤發生的重要途徑，且E6蛋白在此過程中起到重要的作用，但具體機制有待進一步研究。

綜上所述，HLA-G、HLA-E的表達水平與HPV感染均隨著宮頸病變程度的增加而升高，且相互之間存在正相關關系，這3種指標有望作為宮頸癌早期篩查的重要標志物，為疾病的預防和治療提供新的思路。