血管性癡呆大鼠氧化應激、炎癥反應與SIRT1的相關性研究*

段新飛 宋利宏 胡 科 董小雪 房娉平 張 英 賈俊棟 劉衛紅 闞敏宸

血管性癡呆(Vascular Dementia, VD)是造成癡呆的第二大病因，僅次于阿爾茨海默病，且其患病率呈逐年上升趨勢[1, 2]。VD是由于心腦血管疾病以及血流動力學的改變引發的患者認知、學習功能障礙。高血壓、糖尿病、肥胖、吸煙均是誘發血管性癡呆的危險因素[3]。目前有關VD的發病機制尚未完全闡明。大多數研究報道，VD腦組織氧化應激水平增加，促炎因子的水平增加，表明腦組織高水平的氧化應激和炎癥反應參與血管性癡呆的發病過程[4, 5]。因此，減輕腦組織氧化應激和炎癥反應不失為改善VD的重要措施。

沉默信息調節因子1(Silent Information Regulator 1,SIRT1)是Sirtuin家族的成員之一，廣泛分布于腦組織中，如海馬和小腦等[6]。現有的研究發現SIRT1參與多個生物學過程，具有抗炎、抗氧化應激的作用[7, 8]。另有研究表明，SIRT1調節突觸可塑性并參與記憶的形成[9]。然而，SIRT1在VD中的作用有待深入研究。據此，本研究擬探討上調SIRT1對VD大鼠認知功能、氧化應激以及炎癥反應的影響，以期為VD的防治提供新思路。

1 對象與方法

1.1 對象 清潔級SD大鼠30只來自于河北醫科大學生物醫學工程中心[SYXK(冀)2019-007]，體質量為240～260 g。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)以及谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)購買于南京建成生物工程研究所，白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯免疫試劑盒由武漢伊萊瑞特生物科技有限公司提供，抗SIRT1抗體購買于美國Abcam公司，白藜蘆醇購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及VD大鼠模型制備 30只SD大鼠單籠喂養，適應環境1周后將其分為三組：假手術組(Sham組)、血管性癡呆模型組(VD組)和SIRT1激動劑組(RSV組)。本研究VD組采用雙側頸總動脈永久性結扎(2VO)致腦缺血損傷進而建立VD大鼠模型。以35 mg/kg的劑量腹腔注射5%的水合氯醛麻醉大鼠，將麻醉好的大鼠以仰臥位固定其頭部和四肢，頸部備皮并消毒，沿正中線作一皮膚切口，分離筋膜和肌肉，暴露出雙側頸總動脈，然后雙重結扎動脈的近心端和遠心端，用碘酒消毒并縫合傷口，術后要維持大鼠體溫在(36±2)℃，并連續3 d注射青霉素用于預防感染。Sham組僅暴露出雙側的動脈，不做結扎處理。RSV組大鼠在進行2VO手術后連續4周給與白藜蘆醇(20 mg/kg)。給藥完畢后進行行為學分析和生化檢測。

1.2.2 水迷宮實驗 Morris水迷宮用于檢測各組大鼠學習記憶情況，整個實驗分為定位航行和空間探索兩部分。定位航行實驗：每天將實驗大鼠從不同的象限放入水迷宮中，記錄其找到隱藏在水迷宮中平臺的時間，即逃逸潛伏期，若超過120 s大鼠仍未找到平臺，則引導其到平臺停留10 s，本階段實驗持續5 d，且每天大鼠進入水迷宮順序均不一樣。訓練期結束后進行空間探查實驗，撤掉平臺，記錄大鼠穿過平臺的次數以及在目標象限(原平臺所在象限)所花費的時間。

1.2.3 MDA、SOD、GSH-Px活性檢測 水迷宮實驗結束后，將大鼠麻醉處死快速取出腦組織并分離出雙側海馬，一側海馬于-80 ℃，一側海馬組織用預冷的生理鹽水沖洗并將其勻漿4度離心15 min，取上清液用于后續的實驗。MDA、SOD、GSH-Px活性的檢測按照試劑盒說明嚴格進行。

1.2.4 IL-1β和TNF-α的檢測 將海馬組織勻漿并取上清液用于后續實驗。IL-1β和TNF-α濃度檢測操作嚴格按照Elisa說明書進行，測定結束后按照說明書根據標準品濃度和所測的吸光度值繪制出所需標準曲線，然后按照標準曲線計算IL-1β和TNF-α濃度。

1.2.5 Western blot檢測SIRT1蛋白表達水平 將海馬組織勻漿并取上清液，用BCA法測量各組上清液中蛋白總濃度。根據所檢測蛋白分子量制備所需濃度的分離膠和濃縮膠。將樣品經變性等處理后加入凝膠泳道中進行電泳。電泳結束后，將凝膠置于轉印槽內，將蛋白轉至PVDF膜上。之后將PVDF膜置于55 ℃的脫脂牛奶中封閉，接著將膜轉至一抗中孵育過夜。次日再孵育二抗2 h，最后于凝膠成像系統下顯影。

1.2.6 統計學方法 本研究采用SPSS 20.0軟件對所得數據進行分析處理，組間對比采用單因素方差分析，P<0.05視為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠海馬SIRT1蛋白表達水平比較 VD組大鼠海馬SIRT1的蛋白表達水平較Sham組降低(P<0.01)。RSV組大鼠海馬SIRT1蛋白表達水平高于VD組(P<0.05)。見圖1。

注：與Sham組比較，*P<0.01；與VD組比較，△P<0.05

2.2 三組大鼠認知功能比較 與Sham組比較，VD組大鼠逃逸潛伏期延長(P<0.01)；且VD組大鼠穿過平臺的次數以及在目標象限停留時間百分比低于Sham組(P<0.05)。與VD組比較，RSV組大鼠在定位航行實驗中的逃逸潛伏期縮短(P<0.01)；RSV組大鼠在空間探查實驗中穿過平臺的次數和在目標象限停留時間百分比均提高(P<0.05)。見圖2。

注：A：逃逸潛伏期；B：穿過平臺的次數；C：在目標象限停留時間百分比；與Sham組比較，*P<0.01；與VD組比較，△P<0.05

2.3 三組大鼠海馬組織氧化應激水平比較 結果顯示，與Sham組比較，VD組大鼠海馬MDA的活性增加(P<0.001)，SOD和GSH-Px活性減少(P<0.05)。與VD組比較，RSV組大鼠MDA的活性降低(P<0.01)，SOD和GSH-Px活性升高(P<0.05)。見圖3。

注：A：海馬區MDA的水平；B：海馬區SOD的水平；C：海馬區GSH-Px的水平；與Sham組比較，*P<0.05，**P<0.01；與VD組比較，△P<0.05，△△P<0.01

2.4 三組大鼠海馬組織炎癥水平比較 ELISA結果顯示，與Sham組比較，VD組大鼠海馬IL-1β和TNF-α的表達水平升高(P<0.01)。與VD組比較，RSV組大鼠海馬IL-1β和TNF-α的表達水平降低(P<0.01)。見圖4。

注：A：海馬區IL-1β的水平；B：海馬區TNF-α的水平；與Sham組比較，*P<0.01；與VD組比較，△P<0.01

3 討論

VD是由于腦血管疾病以及缺血或出血性疾病引起的認知功能障礙，多發于老年人群[10]。VD嚴重影響了患者的生活質量，加重家庭、社會的負擔。目前，有關VD的發病機制尚未完全闡明，氧化應激以及炎癥是VD的重要發病機制[11, 12]。據此，本研究深入探討了VD氧化應激和炎癥反應的具體機制。

SIRT1是Sirtuin家族成員之一，為NAD+依賴性去乙酰化酶。SIRT1廣泛表達于腦組織，特別是海馬神經元內。研究發現，SIRT1參與細胞增殖、分化、衰老等多個生理功能[13, 14]。另有研究報道，SIRT1調控突觸可塑性，是學習以及形成的重要基礎[15, 16]。因此，本研究觀察了SIRT1在VD中的重要作用。本研究采用2VO法復制VD大鼠模型[17]。與其他研究一致[18]，2VO處理大鼠逃逸潛伏期延長，穿過平臺的次數以及在目標象限停留時間百分比低于Sham組，表明VD模型復制成功。通過Western blot檢測SIRT1的表達，發現VD大鼠海馬區SIRT1的表達降低；給與SIRT1激動劑處理后，VD大鼠SIRT1的表達恢復至正常水平，表明白藜蘆醇上調VD大鼠SIRT1的表達，提示SIRT1參與VD的病理過程。

為了進一步明確SIRT1在VD中的重要作用，本研究通過上調SIRT1的表達，觀察其對VD大鼠認知功能，氧化應激以及炎癥反應的影響。白藜蘆醇是目前運用較廣的SIRT1激動劑[19, 20]。結果顯示，白藜蘆醇處理縮短了VD大鼠在定位航行實驗中的逃逸潛伏期，增加VD大鼠在空間探查實驗中穿過平臺的次數和在目標象限停留時間百分比，表明上調SIRT1的表達可提高VD的認知功能。此外，本研究還檢測了白藜蘆醇處理之后各組大鼠氧化應激指標的變化。RSV組大鼠MDA的活性降低，SOD和GSH-Px活性增加，表明上調SIRT1可減輕VD大鼠海馬氧化應激。此外，本研究還觀察到白藜蘆醇處理大鼠海馬促炎因子IL-1β和TNF-α的水平低于VD組，表明上調SIRT1的表達可抑制VD大鼠炎癥反應。該項研究的發現進一步闡明了VD的病理機制，為該病的防治提供了新靶點和新思路。

綜上所述，本研究發現VD大鼠海馬SIRT1的表達明顯降低，且上調SIRT1的表達可改善VD認知功能障礙，減輕海馬區氧化應激損傷以及炎癥反應，表明SIRT1介導VD氧化應激以及炎癥反應的發生發展過程。