ARMS法在肺腺癌EGFR基因突變檢測中的應用及意義

朱啟淦,陳麗丹,禹 樂,劉金發,任紅岳,耿月華,魁國菊,孟加榕*

(1中國人民解放軍聯勤保障部隊第九○九醫院,廈門大學附屬東南醫院病理科,漳州 363000;2中國人民解放軍聯勤保障部隊第九○九醫院,廈門大學附屬東南醫院老年病房;*通訊作者,E-mail:mengjiarong@sina.com)

肺癌是常見的惡性腫瘤,發病率和死亡率居各類惡性腫瘤之首,嚴重危害人群健康[1]。手術仍是早期患者的最佳治療手段,晚期肺癌的主要治療方案一直是細胞毒化療,但晚期肺癌患者的生存率及預后并不理想[2]。EGFR是一種受體型酪氨酸激酶,通過信號轉導控制腫瘤生長,與新生血管生成、腫瘤的侵襲和轉移等有密切關系,近10年來,針對表皮生長因子受體的酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)在臨床取得顯著療效,引領肺癌靶向治療的前行步伐[3,4]。靶向治療首先要明確EGFR基因狀態,以便合理用藥。本實驗采用ARMS法對廈門大學附屬東南醫院病理科確診的232例肺腺癌不同標本類型檢測EGFR基因突變,分析與患者性別、年齡以及病理類型之間的關系,進而為肺腺癌患者個體化靶向治療提供分子病理學依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集廈門大學附屬東南醫院2019年1-12月肺腺癌標本行EGFR檢測232例。其中男性141例,女性91例;年齡27-89歲,中位年齡64歲。手術切除標本16例,肺活檢標本126例(包括肺穿刺和支氣管鏡活檢),惡性胸腔積液細胞塊標本35例,轉移病灶標本55例(包括淋巴結、骨、肝等轉移)。

1.2 試劑與儀器

GS-脫蠟液購于哈爾濱格林標本技術開發有限公司,石蠟包埋組織切片核酸(paraffin embedded tissue sections DNA,FFPE DNA)提取試劑盒、人類EGFR基因突變檢測試劑盒均購于廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司,Amoydx-Giraffe紫外分光光度計SMA4000,美國ABI7500 Real Time PCR System實時熒光定量PCR儀。

1.3 FFPE DNA的提取

按5-10 μm的厚度對石蠟包埋組織進行切片,取5-10片置于1.5 ml離心管中(組織面積<0.5 cm2者適當增加切片數量),加入GS-脫蠟液1 ml[5],振蕩混勻10 s,室溫13 000g離心2 min,小心去除上清(勿吸到沉淀);加入1 ml無水乙醇,振蕩混勻10 s,室溫13 000g離心2 min,小心去除上清,室溫開蓋放置15 min或37 ℃下開蓋放置5-10 min,使乙醇充分揮發,按FFPE DNA提取試劑盒操作方法及步驟進行樣本基因組DNA提取。DNA需立即檢測,或-20 ℃保存。

1.4 FFPE DNA濃度測定

應用紫外分光光度計檢測DNA樣品濃度與質量,所提DNA濃度的OD260/280應在1.8-2.0之間,OD260/230應大于2。DNA稀釋濃度為2-3 ng/μl。

1.5 ARMS PCR檢測EGFR基因突變

分別向42.3 μl已稀釋為2 ng/μl待檢樣品DNA、EGFR陽性質控品、純化水中加入2.7 μl Taq酶,將混好的DNA樣品依次取5 μl加入8聯PCR反應條中,離心,放入ABI7500實時PCR儀中。反應程序:95 ℃ 5 min,1個循環;95 ℃ 25 s,64 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,15個循環;93 ℃ 25 s,60 ℃ 35 s(采集熒光),72 ℃ 20 s,31個循環。

1.6 結果判斷

EGFR基因突變29位點包括EGFR基因的18、19、20及21外顯子,突變包含Exon-18(G719A、G719S、G719C)、Exon-19(19-Del)、Exon-20(20-Ins、T790M、S768I)、Exon-21(L861Q、L858R)等。突變結果判斷嚴格按照試劑盒說明書提供檢驗結果解釋進行。

1.7 統計學分析

應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析,數據以例數(率)表示,組間比較用χ2檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ARMS法檢測結果

232例肺腺癌標本EGFR基因突變104例,突變率為44.83%(104/232),其中19Del和L858R點突變分別占20.26%(47/232)和22.41%(52/232),19Del和L858R占總突變的95.19%(99/104);稀有突變為2.16%(5/232),1例L858R和T790M雙突變;1例19Del和T790M雙突變;1例G719X和L861Q雙突變;1例20-Ins突變;1例L861Q。EGFR基因擴增曲線見圖1。

圖1 肺腺癌標本EGFR基因擴增曲線Figure 1 Amplification curves of EGFR gene in lung adenocarcinoma specimens

2.2 不同病理參數相互間比較

年齡≥60歲者突變率44.06%(63/143),年齡<60歲者突變率46.07%(41/89),兩者EGFR基因突變率差異無統計學意義。手術切除標本突變率43.75%(7/16),肺活檢標本突變率38.89%(49/126),惡性胸腔積液細胞塊標本突變率62.86%(22/35),轉移病灶標本突變率47.27%(26/55),不同標本類型突變率差異無統計學意義(P>0.05,見表1)。男性患者突變率36.17%(51/141),女性患者突變率58.24%(53/91),女性患者的EGFR突變率高于男性,性別差異有統計學意義(P<0.05,見表1)。

表1 EGFR基因突變率與臨床病理參數的關系 例(%)

3 討論

EGFR基因位于人類7號染色體的短臂上,包括28個外顯子,其酪氨酸激酶功能區由外顯子18-24編碼。EGFR基因是原癌基因C-erbB-1(HER-1)的表達產物,定位于細胞膜上。EGFR主要通過信號傳導方式進入細胞核,可引起細胞核內基因轉錄水平增加,表達水平的增加可引起其下游信號傳遞過程異常,引起細胞生長加快,細胞生存期延長,同時抑制細胞凋亡,與腫瘤的發生發展、預后以及治療反應等相關[6]。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)是針對EGFR基因靶點的小分子抑制劑,多項臨床試驗已證實,EGFR基因突變的肺腺癌患者能從EGFR-TKIs治療中顯著獲益[7,8]。因此,對肺腺癌患者進行EGFR基因突變狀態的檢測可預測其對EGFR-TKIs類藥物的療效。

目前,EGFR基因分型的檢測方法多種多樣,有熒光原位雜交法、高分辨率溶解曲線法[9]、羅氏Cobas系統實時PCR法[10]、微滴數字PCR法[11]、測序法[2]、ARMS法[2]等。各檢測方法的差異主要表現在所用樣本類型、腫瘤細胞含量、檢測方法靈敏度和特異性、報告時限等,而臨床上需要一種快速、靈敏、特異性高的檢測方法。本研究所用ARMS法是基于PCR平臺結合特異引物和雙環探針兩種技術,以達到對EGFR基因突變類型的高檢測能力,檢測突變類型多達29種。針對EGFR基因突變位點設計特異的突變檢測引物,保證了其高度的特異性。且ARMS法靈敏度高,對標本腫瘤細胞DNA的含量及質量要求較低,可檢測靈敏度低至1%的突變[12,13],因此,檢測穿刺、活檢小標本和胸水細胞塊也得到理想的結果。該檢測方法操作簡易,結果直觀易判讀,儀器普及程度高,成本較低,目前已用于國內臨床EGFR基因檢測。

本研究結果顯示,EGFR突變率為44.83%,在所有突變中,19Del和L858R突變率最高,占總突變率的95.19%;女性患者突變率(58.24%)明顯高于男性(36.17%);年齡>=60歲者突變率(44.06%)與<60歲者(46.07%)相近;這些與王芳等[14]報道一致。EGFR基因在不同標本中的突變率,肺手術標本為43.75%、肺活檢標本為38.89%、轉移病灶標本為47.27%及胸水細胞塊為62.86%均與Midha等[15]通過對全球文獻分析發現中國人肺腺癌EGFR突變率在27%-66%的結果基本相符。從突變情況來看35例胸水細胞塊EGFR的突變率高于肺手術標本、肺活檢標本及轉移病灶標本,突變率雖與陳軒等[16]報道一致,但這需要更多的標本例數去驗證。Yatabe等[17]研究發現EGFR基因突變的異質性無論在原發灶、轉移灶還是復發灶中都非常少見;也有研究表明腫瘤在分子水平上表現出異質性,且在腫瘤侵襲和轉移過程中,EGFR基因狀態也極不穩定,即轉移灶與原發灶的基因狀態常常不一致[18,19];因此轉移病灶與原發灶EGFR基因突變的一致性需要更多病例及相關研究來證實。

實驗過程中還需注意：①甲醛對DNA有交聯作用，放置超過3個月的石蠟包埋樣本中DNA片段化和降解較為嚴重，雖紫外分光光度計測量的濃度較高，但實際加入有效DNA量并不足，需要相應增加DNA用量。②雖然市售ARMS試劑盒可檢測EGFR基因突變多達29位點，但對某些稀有或未知突變可能造成漏檢，具有一定的局限性。③對于血性胸腔積液，制作細胞塊前去紅細胞處理和富集有核細胞層，可有效提高血性胸水細胞塊DNA濃度與質量[20-22]。④對于失去手術機會的肺癌晚期患者，肺活檢標本、轉移病灶標本或胸水細胞塊標本可替代手術標本進行EGFR基因檢測，豐富了患者基因檢測的取材途徑。

綜上所述,ARMS技術以簡單、快速、靈敏度低至1%、特異性高、對樣品無污染、可用于不同標本類型等優點,在評估肺腺癌EGFR突變類型方面具有較大的優勢,為臨床需要對EGFR-TKI藥物敏感性的肺腺癌患者提供可靠的檢測方法,是目前臨床較有應用前景的檢測方法。