上皮性卵巢惡性腫瘤中SFRP1的表達及與β-catenin的相關性

顧中亮,尉春艷

(西安交通大學第二附屬醫院婦產科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:weichy1023@163.com)

上皮性卵巢惡性腫瘤在女性生殖系統腫瘤里發病率雖居第3位,其死亡率卻居于首位,且5年生存率小于50%,嚴重威脅女性健康[1,2]。研究表明,分泌型卷曲蛋白1(secretory crimp protein,SFRP1)作為分泌型卷曲相關蛋白家族(secreted frizzled-related proteins family,SFRPs)的一員,由定位于后者8q12-11.1位點的基因編碼[3]。SFRP1作為Wnt的一種特異性拮抗劑可直接作用于Wnt蛋白,從而發揮負調控Wnt/β-catenin信號通路的作用[4,5]。Wnt/β-catenin信號通路對大部分動物的細胞生長、分化、成熟起著關鍵的調控作用,近年來較多研究發現其異常激活與大部分腫瘤如宮頸癌、直腸癌、乳腺癌、胰腺癌等均存在顯著相關性[6]。由于目前SFRP1也被定義為一種新的抑癌基因,其異常表達可能干擾Wnt信號通路進而參與某些腫瘤的發生或轉移[5],但是,其在上皮性卵巢惡性腫瘤的病理發展過程中是否也是通過Wnt/β-catenin信號通路進而參與其中尚未清楚,因此本研究試圖探究其作用機制并報道如下。

1 資料和方法

1.1 研究對象

收集2017年9月至2018年12月于西安交通大學第二附屬醫院就診的85例上皮性卵巢惡性腫瘤患者作為研究對象,年齡為25-58歲。所有患者均接受手術治療并經病理確診(漿液性癌38例,黏液性癌24例,透明細胞癌7例,子宮內膜樣癌16例),且均未接受放療、化療及其他抗腫瘤治療;所有患者均未合并其他原發性腫瘤。患者按(FIGO,2000)標準[7]進行手術-病理分期,其中Ⅰ期34例,Ⅱ期32例,Ⅲ期10例,Ⅳ期9例;按病理學進行分組,其中G1高分化組37例,G2中分化組30例,G3低分化組18例;按是否伴有淋巴結轉移進行分組,其中淋巴轉移組28例,非淋巴轉移組57例。本研究已通過我院倫理委員會審批。

1.2 材料與方法

1.2.1 免疫組化檢測SFRP1表達情況 按照說明書,采用免疫組化(SP)法觀察SFRP1陽性反應情況。試劑由北京雷根生物技術有限公司提供。由病理科醫師,光學顯微鏡下連續選取5個視野,每個視野計數100個細胞,記錄細胞膜與細胞質棕黃色染色的SFRP1陽性細胞總數,隨后計算平均陽性細胞百分含量(5個視野陽性細胞總數÷5×100%)。平均陽性細胞百分含量≤2%為陰性,>2%為陽性[3]。比較不同手術-病理分期、病理學分組、淋巴結轉移情況時SFRP1表達陽性率(計算公式為SFRP1表達陽性例數÷總例數×100%)。

1.2.2 Western blot檢測β-連環蛋白(β-catenin)表達情況 組織經破碎后,蛋白裂解液提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,遵循說明書步驟執行等體積稀釋,4 ℃冰浴下SDS-PAGE電泳,轉移、洗脫、封板、孵育、洗滌,ECL化學發光,顯影。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為參照進行讀數。兔β-catenin一抗及二抗由北京雷根生物技術有限公司提供。采用ImageJ檢測蛋白表達量并計算相對表達量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 上皮性卵巢惡性腫瘤組織SFRP1免疫組化染色

免疫組化染色后,鏡下可見SFRP1陽性細胞的細胞膜與細胞質呈棕黃色染色,但較正常卵巢組織染色程度輕(見圖1)。

2.2 上皮性卵巢惡性腫瘤SFRP1的表達陽性率比較

手術-病理分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者的SFRP1表達陽性率不同,差異有統計學意義(P<0.05);其中Ⅰ期的SFRP1表達陽性率顯著高于Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期,差異均有統計學意義(均P<0.05)。不同病理學分級患者的SFRP1表達陽性率差異無統計學意義(P>0.05)。有淋巴結轉移組患者的SFRP1表達陽性率顯著低于無淋巴結轉移組,差異有統計學意義(P<0.05,見表1)。

表1 不同臨床特征上皮性卵巢惡性腫瘤患者的SFRP1表達

2.3 上皮性卵巢惡性腫瘤β-catenin蛋白表達的比較

不同手術-病理分期上皮性卵巢惡性腫瘤的β-catenin蛋白相對表達量不同(P<0.05),從Ⅰ-Ⅳ期β-catenin相對表達量逐漸增高,差異有統計學意義(P<0.05)。不同病理學分組上皮性卵巢惡性腫瘤的β-catenin相對表達量差異無統計學意義(P>0.05)。上皮性卵巢惡性腫瘤伴有淋巴結轉移時,β-catenin相對表達量高于無淋巴結轉移患者,差異有統計學意義(P<0.05,見表2)。

A.上皮性卵巢惡性腫瘤組織 B.正常卵巢組織陽性對照圖1 上皮性卵巢惡性腫瘤組織SFRP1免疫組化染色情況 (×400)Figure 1 Immunohistochemical staining of SFRP1 in epithelial ovarian malignant tumor (×400)

表2 上皮性卵巢惡性腫瘤β-catenin表達情況

2.4 上皮性卵巢惡性腫瘤SFRP1平均陽性細胞百分含量與β-catenin的相關性

由Pearson分析可見,上皮性卵巢惡性腫瘤SFRP1平均陽性細胞百分含量與β-catenin表達量呈負相關性(r=-0.757,P<0.001,見圖2)。

圖2 上皮性卵巢惡性腫瘤SFRP1平均陽性細胞百分含量與β-catenin的相關性Figure 2 Correlation between the percentage of SFRP1 positive cells and β-catenin in epithelial ovarian malignant tumors

3 討論

由于SFRPs在腫瘤染色體中頻繁出現某等位基因的表達缺失[8],因此被廣泛關注,而SFRP1作為其中一員,在抑制腫瘤的發生中也具有重要作用[9]。既往有研究發現,SFRP1參與了卵巢癌的發生、發展,且在高淋巴轉移能力的卵巢癌中表達減少[10],但其在上皮性卵巢惡性腫瘤發生、發展中的作用及機制尚未完全明確。通過對上皮性卵巢惡性腫瘤確診患者腫瘤組織的研究,我們發現,上皮性卵巢惡性腫瘤在手術-病理分期Ⅲ期、Ⅳ期及有淋巴結轉移時,SFRP1表達陽性率明顯降低,這與張孝艷等[11]及曹麗雯等[5]在宮頸癌中的研究結果相近。其中張孝艷等[11]在對比正常宮頸組織、宮頸上皮內瘤變、宮頸癌組織的SFRP1表達陽性情況后,即發現三者的表達陽性率依次降低,且伴隨宮頸癌手術-病理分期升高逐漸下降并以Ⅳ期最低;但不同之處在于有淋巴結轉移者的SFRP1表達陽性率高于無轉移者。在針對其他系統腫瘤的研究中,也發現與本研究類似的SFRP1陽性表達情況,如王建等[12]在對非小細胞肺癌組織的檢測中即發現,癌癥手術-病理分期越高,SFRP1表達陽性率越低,伴有淋巴結轉移時的表達陽性率也低于未轉移者;Buim等[13]也發現,在侵襲性膀胱癌中,腫瘤手術-病理分期越高,SFRP1表達陽性率越低。然而,也有研究發現,在某些腫瘤中,SFRP1表達情況與上述不同。如Sanini等[14]發現,在轉移性腎細胞癌中,SFRP1存在過度表達現象;Hoei-Hansen等[15]發現,在睪丸原位癌中,SFRP1較正常睪丸組織也呈現過度表達;另外,Joesting等[16]也發現,前列腺腫瘤較正常成人前列腺,其SFRP1表達也顯著增高;而Lin等[17]發現,在慢性應激所致肝細胞癌中,SFRP1表達也呈增高趨勢。分析在不同疾病中SFRP1表達情況不同的原因,可能是因為在不同器官組織里SFRP1參與腫瘤發展所關聯的信號通路不同所致,也可能因為在不同組織中SFRP1基因表達下調分別為缺失或甲基化等不同原因所致[8,18,19]。

有研究表明,多種腫瘤及其臨床分型、分化程度及侵襲性均與SFRP1異常降低相關[20-22],而該作用主要通過SFRP1對Wnt信號通路調控實現[23-25]。Wnt蛋白是一種分泌性糖蛋白家族,參與細胞分化、生長的調控,而Wnt/β-catenin是其主要信號通路。Wnt/β-catenin信號通路調控異常已被證實在多種腫瘤如肝癌、甲狀腺癌、鼻咽癌、胃癌等中有重要作用[6,26-30],且有研究表明該信號通路在卵巢癌的發生發展中有重要作用[31-34],而SFRPs作為Wnt的特異性拮抗劑之一,是否通過Wnt/β-catenin通路在上皮性卵巢惡性腫瘤的發展過程中發揮作用,尚不清楚。我們通過對不同手術-病理分期、不同病理學分級和淋巴轉移情況上皮性卵巢惡性腫瘤中β-catenin的檢測,發現:從手術-病理分期Ⅰ期至Ⅳ期β-catenin相對表達量逐漸增高,而上皮性卵巢惡性腫瘤伴有淋巴結轉移時的β-catenin相對表達量高于無淋巴結轉移患者,上述情況均與SFRP1陽性表達情況趨勢相反;而不同病理學分級上皮性卵巢惡性腫瘤的β-catenin相對表達量無統計學差異,此特征也與SFRP1陽性表達情況相似。通過進一步分析SFRP1平均陽性細胞百分含量與β-catenin表達的關系,可見兩者呈強負相關,提示SFRP1可能通過Wnt/β-catenin信號通路進而于上皮性卵巢惡性腫瘤的發生發展及侵襲過程中發揮作用。分析其機制,上皮性卵巢惡性腫瘤時,Wnt/β-catenin信號通路激活且調節異常[31,34],SFRP1高表達時可抑制該通路,改善腫瘤的臨床分級及侵襲性;但是,SFRP1并非僅發揮拮抗劑的作用,還具有雙向性,即高表達時可拮抗Wnt/β-catenin信號通路,但低表達時可激活Wnt/β-catenin通路進而導致腫瘤臨床分級增加、侵襲性增加[23,35,36]。然而,不同病理學分級上皮性卵巢惡性腫瘤的SFRP1陽性表達情況及β-catenin表達無統計學差異,其原因仍有待進一步實驗分析。

綜上所述,上皮性卵巢惡性腫瘤中SFRP1與β-catenin表達存在著顯著負相關性,SFRP1可能通過Wnt/β-catenin信號通路參與上皮性卵巢惡性腫瘤的發生、發展,值得關注。