二甲雙胍和紫草素對人鼻咽癌細胞CNE-2Z增殖及凋亡的影響及其機制

王楠楠,蘇 凱,崔憶旋,陶 露,時宗芬,陳曉芬,翟麗倩,馬士崟,趙 報

(蚌埠醫學院第一附屬醫院耳鼻咽喉科,蚌埠 233000;*通訊作者,E-mail:mashiyinent@sina.com;#共通訊作者,E-mail:Zhaobao86@126.com)

鼻咽癌發生于鼻咽腔頂部和側壁,是一種頭頸部常見的惡性腫瘤。其病因與遺傳、環境以及EB病毒等有關。好發于中年男性,但可發于任何年齡組。發病位置隱蔽,臨床癥狀不明顯,常常因廣泛侵潤周圍組織及發生淋巴轉移后才發現,故診斷較困難,且預后較差。與T1-2期鼻咽癌患者相比,T4期患者的5年局部控制率較差,預后不良,因此臨床治療鼻咽癌的關鍵為有效降低腫瘤遠處轉移率,提高晚期腫瘤患者的局部控制率[1]。二甲雙胍(metformin)是一種有效的口服降血糖藥物,近年來研究發現,該藥能降低糖尿病患者的腫瘤罹患率,抑制腫瘤細胞的生長[2];已有研究表明二甲雙胍能顯著提高非小細胞肺癌、子宮內膜癌、結直腸癌患者生存率。它能夠激活AMPK通路,抑制細胞有氧呼吸,從而抑制腫瘤細胞增殖[3-9]。還有多項研究證實二甲雙胍可以提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。體內及體外實驗證實其能夠抑制腫瘤細胞生長及侵襲、遷移能力,為惡性腫瘤治療提供了新的研究方向。已有研究證明壞死性凋亡是一種可調控的程序性細胞死亡方式,目前的研究表明,壞死性凋亡是由RIPK3(receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 3)以及其底物MLKL(mixed lineage kinase domain-like protein)共同介導,對于機體的生長發育和組織器官的穩態具有重要作用。此外,對腫瘤耐藥細胞株的研究證實,在規避腫瘤多藥耐藥方面壞死性凋亡誘導劑具有“廣譜性”[10-14]。紫草素(shikonin)是從紫草中提取的一種萘醌類物質。丙酮酸脫氫酶作為糖酵解的關鍵酶,已有研究表明,紫草素不僅可以通過抑制其亞型PKM2從而抑制糖酵解,還可以通過抑制PKM2誘導細胞發生壞死性凋亡[15]。本研究旨在探討二甲雙胍和紫草素聯用對于鼻咽癌細胞CNE-2Z的作用形式及其可能分子機制,為鼻咽癌的臨床治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 細胞株及主要試劑

人鼻咽癌細胞CNE-2Z購自美國ATCC公司,培養于蚌埠醫學院藥學院生化實驗室。RPMI-1640培養基、胰蛋白酶(含EDTA)購自公司美國Hyclone公司,胎牛血清(FBS)購自浙江天杭生物科技股份有限公司,MTT試劑、雙染細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin Ⅴ FITC/PI)、BCA蛋白定量試劑盒購于上海碧云天公司,Bcl-2、Bax、RIP1、RIP3蛋白抗體購自美國CST公司。

1.2 細胞培養

人鼻咽癌細胞CNE-2Z培養于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/L鏈霉素的RPMI-1640培養基中,于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。

1.3 MTT實驗檢測細胞增殖

取對數期生長狀態良好的CNE-2Z接種入96孔板,調整每孔培養液為100 μl,細胞數為7 000。將細胞分為4組:空白組、二甲雙胍組、紫草素組、二甲雙胍+紫草素組。待細胞貼壁后,空白組不做處理,二甲雙胍組加入濃度為40 mmol/L的二甲雙胍藥液,紫草素組加入濃度為3 μmol/L的紫草素藥液,二甲雙胍+紫草素組加入濃度為40 mmol/L的二甲雙胍和3 μmol/L的紫草素混合藥液,放入37 ℃、5% CO2培養24,48,72 h,每孔加入15 μl濃度為5 g/L的MTT溶液,繼續培養4 h,去上清,每孔加入150 μl DMSO,37 ℃孵育30 min,檢測吸光度值(OD490)。細胞存活率=實驗組OD490/對照組OD490×100%。取平均值繪制藥物劑量效應曲線,計算藥物的半數抑制濃度(IC50)。

1.4 藥物協同作用Isobologram分析

根據MTT實驗結果,得到不同濃度二甲雙胍、紫草素對CNE-2Z細胞的IC50,分別設為M和S,標于橫坐標軸和縱坐標軸上,連接M、S兩點的直線為相加線。同時根據MTT實驗結果,求得不同濃度二甲雙胍與低濃度紫草素(3 μmol/L)聯用時的IC50濃度b,若Q(a,b)點在MS連線上,則表示兩藥聯用為相加作用;在該連線以下,表示兩藥聯用為協同作用;在該連線以上,表示兩藥聯用為拮抗作用[16]。

1.5 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡

選對數期生長狀態良好的CNE-2Z細胞,接種于6孔板(3×105個/孔),將細胞分為4組:空白組、二甲雙胍組、紫草素組、二甲雙胍+紫草素組。待細胞貼壁后,空白組不做處理,二甲雙胍組加入濃度為40 mmol/L的二甲雙胍藥液,紫草素組加入濃度為3 μmol/L的紫草素藥液,二甲雙胍+紫草素組加入濃度為40 mmol/L的二甲雙胍和3 μmol/L的紫草素混合培養液。放入37 ℃、5% CO2的培養箱中培養48 h,用不含EDTA的胰酶消化細胞,600g離心5 min,用PBS清洗2次,其中空白組分為4份,分別為空白對照組、Annexin Ⅴ-FITC組、PI組以及對照組。每組加入200 μl Annexin Ⅴ-FITC結合液,加入2.5 μl的Annexin Ⅴ-FITC染色液,4 ℃避光冰浴15 min加入5 μl PI染色液,繼續4 ℃避光冰浴5 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率,此實驗重復3次。

1.6 侵襲遷移實驗檢測細胞侵襲遷移能力

將按1 ∶4稀釋好的matrigel鋪于Transwell小室濾膜上，置于37 ℃培養箱過夜凝膠。取對數期生長的CNE-2Z細胞以每孔30×104接種于6孔板，貼壁后細胞分為4組：空白組、二甲雙胍組、紫草素組、二甲雙胍+紫草素組，分別加入2 ml培養液、濃度為40 mmol/L的二甲雙胍藥液、濃度為3 μmol/L的紫草素藥液、濃度為40 mmol/L的二甲雙胍和3 μmol/L的紫草素混合藥液，37 ℃、5% CO2培養24 h吸除培養液，PBS清洗2次，消化離心細胞，用不含血清的培養液重懸細胞，并調整細胞密度為3×105/ml。每組取100 μl細胞懸液分別加入含有matrigel和不含matrigel的Transwell小室中，向24孔板下室加入500 μl含血清的完全培養液，將接種好的24孔板放入37 ℃、5%CO2的培養箱中繼續培養48 h吸去培養液，用4%多聚甲醛4 ℃固定20 min，吸去多聚甲醛，用棉簽輕輕擦去matrigel及小室內的細胞，用結晶紫避光染色15 min，PBS洗3次，晾干后于顯微鏡下觀察計數。

1.7 平板克隆形成實驗檢測細胞集落形成能力

取對數期生長的CNE-2Z細胞以每孔3×105個接種于6孔板,待貼壁后吸去上清并分別加入2 ml培養液、濃度為40 mmol/L的二甲雙胍藥液、濃度為3 μmol/L的紫草素藥液濃度為40 mmol/L的二甲雙胍和3 μmol/L的紫草素混合藥液,37 ℃、5% CO2培養12 h。吸去培養液,用PBS洗2次,消化離心細胞，用培養液重懸細胞，并調整細胞密度為3×105/ml。取30 μl細胞懸液種于6孔板中，每孔加入2 ml培養液,37 ℃、5% CO2繼續培養6 d。每個處理組細胞設置2個復孔,待培養至出現肉眼可見的克隆后,吸去培養液，用PBS清洗3次，用4%多聚甲醛4 ℃固定20 min，吸去多聚甲醛，每孔加入1 ml結晶紫染液,避光染色15 min，PBS洗3次，晾干后于顯微鏡下計數。

1.8 Western blot法檢測Bcl-2、Bax、RIP1、RIP3、MMP9蛋白表達水平

取對數期生長良好的鼻咽癌細胞CNE-2Z細胞，以每孔3×105接種于6孔板，PBS洗2次，加入60 μl含有PMSF的裂解液，4 ℃過夜，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，取上清液，用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，計算出每組樣本所需上樣量。將蛋白總量相同的樣本加入到蛋白凝膠內，90 V恒壓待溴酚藍到達分離膠的底部后終止。80 V恒壓將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜。室溫搖床下用快速封閉液封閉15 min，使用TPBS洗滌5 min，重復3次。按1 ∶1 000的比例分別稀釋β-actin、Bcl-2、Bax、RIP1、RIP3、MMP-9一抗，搖床搖晃1 h，4 ℃過夜。用TPBS按照1 ∶5 000稀釋的HRP標記山羊抗兔IgG孵育2 h，ECL發光試劑盒顯影。

1.9 統計學分析

采用SPSS21.0軟件分析實驗數據,實驗數據以均數±標準差表示,各組間差異采用多因素方差分析和LSD-t檢驗比較各組間差異,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 二甲雙胍和紫草素聯用對CNE-2Z細胞增殖的影響

MTT結果顯示,二甲雙胍與紫草素聯合作用于細胞48 h,細胞抑制率顯著強于二者單藥作用(見圖1),與單藥組相比差異具有統計學意義(P<0.05)。此外,通過Isobologram分析發現,40 mmol/L二甲雙胍及其與3 μmol/L紫草素聯用對CNE-2Z細胞的IC50坐標(3,40)落在M(二甲雙胍IC50)與S(紫草素IC50)相加線左下方(見圖2),表明40 mmol/L二甲雙胍和3 μmol/L紫草素聯用具有協同作用,所以選用40 mmol/L的二甲雙胍和3 μmol/L紫草素進行后續實驗。

圖2 Isobologram分析二甲雙胍與紫草素聯用的協同作用Figure 2 Isobologram analysis of the synergistic effect of metformin combined with shikonin

與其他三組比較,*P<0.05圖1 不同處理方式對CNE-2Z細胞增殖的影響Figure 1 Effects of metformin and shikonin on proliferation of CNE-2Z cells

2.2 二甲雙胍和紫草素聯用對CNE-2Z細胞凋亡的影響

Annexin Ⅴ-FITC雙染結果顯示,空白組凋亡率為9.79%±0.7%,二甲雙胍組細胞凋亡率為21.82%±0.5%,紫草素組細胞凋亡率為22.05%±0.5%,二甲雙胍+紫草素組細胞的凋亡率為55.8%±0.3%。二甲雙胍、紫草素都可以促進CNE-2Z細胞凋亡,且聯合效果更加顯著,與單藥組相比差異具有統計學意義(P<0.05,見圖3)。

圖3 不同處理方式對CNE-2Z細胞凋亡的影響Figure 3 Effects of metformin and shikonin on apoptosis of CNE-2Z cells

2.3 二甲雙胍和紫草素聯用對CNE-2Z細胞侵襲遷移能力的影響

檢測結果表明,與單藥相比,二甲雙胍和紫草素聯用能明顯抑制CNE-2Z細胞的侵襲遷移能力,差異具有統計學意義(P<0.05,見圖4)。

2.4 二甲雙胍和紫草素聯用對CNE-2Z細胞克隆形成能力的影響

平板克隆實驗結果示,二甲雙胍+紫草素組細胞集落數明顯低于二甲雙胍組、紫草素組,與單藥組相比差異具有統計學意義(P<0.05,見圖5)。

與其他三組比較,*P<0.05圖4 不同處理方式對CNE-2Z細胞侵襲遷移能力的影響Figure 4 Effects of metformin and shikonin on invasion and migration of CNE-2Z cells

圖5 不同處理方式對CNE-2Z細胞克隆形成的影響Figure 5 Effects of metformin and shikonin on the colony formation of CNE-2Z cells

2.5 二甲雙胍和紫草素聯用對CNE-2Z細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax及MMP-9、RIP1、RIP3表達的影響

檢測結果表明,二甲雙胍和紫草素聯用可下調Bcl-2和MMP-9的表達和上調Bax、RIP1和RIP3的表達,與單藥組相比,差異具有統計學意義(P<0.05,見圖6)。

與其他三組比較,*P<0.05圖6 不同處理方式對CNE-2Z細胞凋亡相關蛋白表達的影響Figure 6 Effects of metformin and shikonin on expression of apoptosis-related proteins in CNE-2Z cells

3 討論

鼻咽癌是我國高發惡性腫瘤之一,且近年來發病人群有逐漸擴大的趨勢,腫瘤細胞由于其快速生長的特點,并且腫瘤組織的血管結構異常導致供血減少,故缺氧是腫瘤細胞普遍存在的狀態,因此糖酵解在腫瘤細胞中代謝活躍。二甲雙胍抗腫瘤細胞的增殖和凋亡作用是近幾年的研究熱點,它作為降糖藥物最重要的機制便是AMPK依賴的降糖機制。它能特異性地抑制細胞中的線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ,下調丙酮酸脫氫酶表達,引起線粒體有氧呼吸功能減弱、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)生成減少,AMP/ATP的比例升高,從而激活AMPK,抑制糖質新生、脂肪生成和蛋白質合成,因此,AMPK同樣可以通過此途徑抑制腫瘤細胞增殖[3]。丙酮酸激酶作為糖酵解的限速酶,其亞型PKM2在腫瘤細胞里特異、高度表達,紫草素作為一種萘醌類物質普遍認為是PKM2的抑制劑,其抗腫瘤機制研究已取得一定進展,它通過抑制腫瘤細胞糖酵解,導致腫瘤細胞能量供應不足從而抑制其增殖[17],除此之外,紫草素還能夠通過調控受體相互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1,RIPK1)/受體相互作用蛋白3(receptor-interacting protein 3,RIPK3)的表達誘導細胞發生壞死性凋亡。

凋亡蛋白Bcl-2和Bax的作用機制是通過線粒體途徑介導cyt-c等物質的釋放、改變線粒體外膜的通透性、改變線粒體形態、影響膜間隙蛋白釋放及caspase級聯活化等途徑影響細胞凋亡過程而調控細胞凋亡[18-21],二甲雙胍和紫草素聯合作用時Bcl-2活性下調,Bax活性上調且較單藥作用更明顯,說明聯合用藥可能調控線粒體凋亡途徑促進CNE-2Z細胞凋亡且較單藥作用更強。

MMP9能夠專一降解基膜中的Ⅳ型膠原蛋白,從而使腫瘤細胞失去阻隔作用,促進腫瘤細胞的侵襲、轉移。壞死性凋亡是紫草素誘導細胞凋亡方式之一,RIP1和RIP3是壞死性凋亡的關鍵蛋白,RIP1通過激酶依賴性和非依賴性功能調節細胞死亡和炎癥,RIP1和RIP3最后通過磷酸化的方式形成復合體,誘導細胞凋亡[22]。當二甲雙胍和紫草素聯合作用于CNE-2Z細胞時,MMP9活性較單藥明顯降低,RIP1和RIP3活性較單藥明顯增高,表明聯合用藥可抑制腫瘤細胞基膜降解并協同促進紫草素誘導的壞死性凋亡作用。

綜上,二甲雙胍聯合紫草素作用于鼻咽癌CNE-2Z細胞具有協同作用,可通過激活線粒體凋亡途徑[23,24]、促進細胞壞死性凋亡來誘導細胞凋亡,及降低MMP9活性從而抑制鼻咽癌細胞CNE-2Z的侵襲轉移。