褪黑素對H9c2心肌細胞缺氧/復氧損傷的保護作用及其機制

楊吉平,費 琳,鐘鈺西,余 蕾,茍興春*

(1西安醫學院基礎醫學研究所,陜西省缺血性心血管疾病重點實驗室,西安 710021;2西安交通大學第一附屬醫院精神科;*通訊作者,E-mail:447962736@qq.com)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是導致人類死亡的主要原因之一,通過溶栓治療或經皮冠狀動脈內支架術使心肌組織恢復血流供應的同時常常合并出現心肌缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)[1]。如何避免或減輕IRI已成為AMI治療研究中的難點,心肌IRI是一個極其復雜的病理生理過程,其機制尚不完全清楚,主要包括氧化應激、細胞內鈣超載、炎癥反應,以及細胞凋亡和細胞壞死等[2-4]。傳統觀點認為,壞死是被動的、不可逆的細胞死亡。然而,最近研究發現了一種可受調控的程序性細胞壞死(necroptosis)途徑,通過阻斷這種細胞壞死通路,可以明顯縮小心肌梗死的面積,改善心功能[5]。褪黑素(melatonin,MLT)是由松果體產生的一種內源性吲哚類激素,近年來的研究表明,MLT是保護心肌組織缺血性損傷很有潛力的藥物[6],但是MLT抗心肌缺血的機制尚未完全闡明,成為限制其進一步研發和臨床應用的瓶頸[7]。為此,本研究從程序性細胞壞死信號通路為切入點,探討MLT在H9c2心肌細胞缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)損傷中的保護作用和機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株

H9c2細胞為大鼠胚胎心肌細胞株,購自中國科學院上海生命科學研究所。

1.2 主要試劑和儀器

DMEM培養基購自美國Gibco公司,CCK-8細胞增殖和毒性檢測試劑盒購自上海睿時生物科技有限公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性檢測試劑盒購自廣州偉伯科技有限公司;MLT和碘化丙啶(propidium iodide,PI)購自美國Sigma公司;受體相互作用蛋白激酶3(receptor interaction protein kinase 3,RIPK3)抑制劑GSK-872購自北京百奧萊博科技有限公司;兔抗RIPK3多克隆抗體購自美國Milipore公司,兔抗磷酸化鈣離子/鈣調蛋白依賴蛋白激酶(phosphorylated Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase,p-CaMK)Ⅱ多克隆抗體購自上海Cell Signaling Technology公司。細胞培養箱購自美國Thermo公司;SpectraMax iD3酶標儀購自上海美谷分子儀器公司,Western blot成像系統購自上海天能科技有限公司。

1.3 分組及藥物干預

將H9c2心肌細胞隨機分為對照組、H/R組、MLT組、RIPK3抑制劑GSK-872組。根據參考文獻[8],將細胞置于37 ℃,95%N2,5%CO2的培養箱中缺氧處理4 h,然后,在20%O2,5%CO2培養箱中復氧6 h,建立H/R模型。MLT組和GSK-872組細胞在H/R前2 h分別給予MLT(終濃度100 μmol/L)和GSK-872(終濃度5 μmol/L)預處理。對照組是用DMEM培養液在正常條件下培養,不進行藥物干預。

1.4 CCK-8法檢測細胞活力

細胞處理結束后,先將培養液吸棄,用0.01 mol/L PBS洗3次,加入不含血清的DMEM培養液100 μl及CCK-8檢測液10 μl,在37 ℃,5%CO2細胞培養箱內避光孵育2 h,酶標儀檢測吸光度(450 nm)。

1.5 培養液中LDH活性檢測

測定各組細胞培養液中LDH活性來判斷心肌細胞損傷的情況。各組細胞處理結束后,收集培養瓶中的細胞培養液,嚴格按照廣州偉伯科技有限公司試劑盒說明書方法檢測各組細胞培養液中LDH的活性。

1.6 碘化丙啶(PI)染色觀察細胞壞死情況

各組細胞處理結束后,棄掉培養液,用0.01 mol/L PBS洗3次,加入終濃度為5 μmol/L的碘化丙啶(propidium iodide,PI)及Hoechst 33342(5 mg/L),37 ℃,避光孵育30 min,用PBS洗3次,每次5 min;4%多聚甲醛固定10-15 min;激光共聚焦顯微鏡觀察拍照,并比較各組壞死細胞的數量。

1.7 Western blot檢測RIPK3和p-CaMK Ⅱ蛋白的表達量

細胞處理結束后立即吸去培養液,用冰PBS洗滌2次,棄去PBS并吸干殘液,加入含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液100 μl,收集細胞于離心管中,在冰上超聲裂解20 min,4 ℃離心,12 000 r/min,15 min;將上清液轉至另一離心管中,用BCA法進行蛋白定量,每孔取30 μg總蛋白上樣,SDS-PAGE電泳,將蛋白轉移至PVDF膜,用5%脫脂奶粉封閉1 h,TBST漂洗3次,分別加入RIPK3抗體(1 ∶400)、p-CaMK Ⅱ抗體(1 ∶800)和β-actin抗體(1 ∶2 000),4 ℃過夜,TBST漂洗后,加入HRP標記的山羊抗兔的二抗(1 ∶3 000),室溫孵育2 h;TBST漂洗3次,每次10 min,ECL發光,蛋白表達條帶應用Image J軟件進行灰度分析。

1.8 統計學分析

以上數據以均數±標準差表示,采用SPSS 19.0軟件進行統計,多組間的比較采用單因素方差分析,以P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態變化及細胞活力檢測結果

與對照組相比,H/R處理后,倒置顯微鏡下觀察到H9c2心肌細胞明顯皺縮,胞體變短,密度減小,細胞活力顯著下降(P<0.01)。與H/R組相比,MLT組大多數細胞呈長梭形,死亡的細胞明顯減少,密度增大,細胞活力顯著提高(P<0.01);GSK-872組細胞密度也顯著增大,呈梭形,與MLT組相比細胞活力沒有明顯變化(P>0.05,見圖1)。

2.2 MLT對H/R處理后H9c2心肌細胞培養液中LDH活性的影響

與對照組相比,H/R組H9c2心肌細胞培養液中LDH活性顯著升高(P<0.05)。與H/R組相比,MLT組H9c2心肌細胞培養液中LDH活性明顯降低(P<0.01)。GSK-872組LDH活性與MLT組相比無顯著差異(P>0.05,見圖2)。

與對照組比較,**P<0.01;與H/R組比較,##P<0.01圖2 MLT對H/R處理后H9c2心肌細胞培養液中LDH活性的影響 (n=6)Figure 2 Effect of MLT on LDH activity in cell culture medium after H/R treatment (n=6)

2.3 MLT對H/R處理的H9c2心肌細胞壞死數量的影響

用PI染色觀察各組細胞壞死的情況,與對照組比較,H/R組H9c2心肌細胞PI陽性細胞數量顯著增加(P<0.01)。與H/R組相比,MLT組H9c2心肌細胞PI陽性細胞顯著減少(P<0.01);GSK-872組PI染色陽性細胞數與MLT組相比無顯著差異(P>0.05,見圖3)。

與對照組比較,**P<0.01;與H/R組比較,##P<0.01圖3 MLT對H/R處理的H9c2心肌細胞壞死數量的影響 (n=6)Figure 3 Effect of MLT on number of necrotic H9c2 cells after H/R treatment (n=6)

2.4 MLT對H/R處理的H9c2心肌細胞RIPK3和p-CaMK Ⅱ蛋白表達的影響

與對照組相比,H/R組H9c2心肌細胞RIPK3和p-CaMK Ⅱ蛋白的表達均顯著增加(P<0.01)。與H/R組相比,MLT組H9c2心肌細胞RIPK3和p-CaMK Ⅱ蛋白的表達均顯著下調(P<0.01);而GSK-872組RIPK3和p-CaMK Ⅱ的表達與MLT組相比無顯著差異(P>0.05,見圖4)。

與對照組比較,**P<0.01;與H/R組比較,##P<0.01圖4 各組H9c2心肌細胞中RIPK3和p-CaMK Ⅱ蛋白表達水平的比較 (n=3)Figure 4 Expressionof RIPK3 and p-CaMK Ⅱ proteins in H9c2 cells after different treatment (n=3)

3 討論

治療急性缺血性心臟病的核心是快速疏通堵塞或狹窄的冠狀動脈,恢復心肌血液供應,但缺血的心肌組織在血供恢復的同時,常常伴有IRI,反而加重心肌損傷,這是AMI患者治療后出現嚴重并發癥,甚至死亡的主要原因[9]。本研究選用大鼠胚胎期H9c2心肌細胞作為實驗對象,先將細胞缺氧處理4 h,然后再復氧6 h以模擬體內心肌IRI,結果顯示H/R組H9c2細胞活力明顯下降,細胞培養液中LDH釋放量明顯增加,PI染色陽性細胞數較對照組顯著增加,表明經過H/R處理后,細胞壞死的數量明顯增多,而Western blot檢測顯示,H/R組細胞的RIPK3和p-CaMK Ⅱ蛋白表達水平較對照組顯著增加,表明這種細胞死亡是由RIPK3/CaMK Ⅱ信號通路介導的程序性細胞壞死,這與文獻報道一致[10]。

在心肌IRI中,細胞的死亡方式有兩種,即細胞凋亡和細胞壞死。近年研究發現了一種新型的細胞壞死方式,稱之為“程序性細胞壞死”,它是可以被調控的,當“死亡信號”被激活或細胞凋亡被抑制時,受體相互作用蛋白激酶1(RIPK1)與RIPK3發生結合,并促使RIPK3磷酸化,進而激活下游信號,如混合譜系激酶域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL),形成壞死小體,最終導致細胞死亡[11,12],并可誘發明顯的炎癥反應,進一步加重心肌損傷[13]。隨著程序性壞死信號通路研究的不斷深入,針對其關鍵分子的干預策略在心肌損傷與重構中逐漸被人們所關注。

MLT是松果體分泌的一種神經內分泌激素,目前研究發現MLT在心血管系統的多種病理模型中具有明確的調節作用,尤其是其具有明顯的抗心肌IRI作用,并且由于其屬于內源性物質,幾乎沒有毒副作用,因此,MLT在心血管疾病中的應用將是一個極有前途的研究領域。另有研究結果表明,MLT可降低大鼠心肌IRI的梗死面積,是與其減輕內質網應激、減少細胞凋亡有關[14],但MLT保護心肌的分子機制尚未完全闡明,成為限制其臨床應用的瓶頸。本研究結果顯示:MLT可顯著升高經H/R處理的H9c2心肌細胞的活力,降低細胞培養液中LDH釋放量,減少壞死細胞的數量,這表明MLT對H/R處理的H9c2心肌細胞具有顯著的保護作用。Wesern blot結果顯示,MLT顯著下調H/R處理的H9c2細胞中RIPK3和p-CaMK Ⅱ蛋白的表達,提示MLT減少細胞壞死可能與其抑制RIPK3/CaMK Ⅱ信號通路有關。

最近有研究表明,在心肌組織中,CaMK Ⅱ是RIPK3的下游分子,RIPK3可直接與CaMK Ⅱ結合,并使其磷酸化,這是心肌細胞發生程序性壞死的關鍵[15]。GSK-872是RIPK3的一種特異性抑制劑,能高親和力結合RIPK3激酶的結構域[16]。本研究將GSK-872預處理的H9c2心肌細胞作為陽性參照,以探討MLT對H9c2心肌細胞H/R損傷的分子機制和保護效果,結果顯示GSK-872可顯著增加H/R組細胞的活力,減低LDH的釋放,減少壞死細胞的數量,并下調H/R處理后p-CaMK Ⅱ蛋白的表達。

綜上所述,本研究用MLT作用于H/R處理的H9c2心肌細胞,研究結果顯示MLT可通過抑制RIPK3/CaMK Ⅱ信號通路,從而減少細胞壞死的發生。然而,MLT在H/R損傷中保護H9c2心肌細胞的CaMK Ⅱ下游機制仍然不清楚,是否能通過抑制線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)的開放,降低細胞內鈣超載,有待進一步研究。