正丁基苯酞通過抑制心力衰竭大鼠心房重構降低心房顫動易感性

劉 洋,梁 瀟,李晶瑾,郝 翔,折劍青

(西安交通大學第一附屬醫院心血管內科,西安 710061;*通訊作者,E-mail:jianqingshe@xjtu.edu.cn)

心房顫動(atrial fibrillation,AF)是一種臨床常見的持續性心律失常,也是心力衰竭(heart failure,HF)的常見并發癥,目前的房顫治療方法在某種意義上是一種姑息治療[1]。有學者提出了一種新的治療理念,即所謂的上游治療,其旨在通過抑制心房結構重塑(atrial structural remodeling,ASR)來預防或抑制房顫,并從理論上徹底改善這種情況[2]。然而,在上游治療中可供選擇和使用的有效藥物卻相對有限。多項研究證實,氧化應激和炎癥與心房結構重塑有關,包括心房增大、纖維化和間隙連接重塑[3]。活性氧水平升高與活化的促炎介質和細胞因子有關,從而介導心房成纖維細胞過度增殖、促進膠原沉積、加重心房結構重塑,最終導致房顫形成[1]。因此,抗氧化劑和抗炎方法可能會抑制心房結構重塑,從而抑制房顫的發生。

正丁基苯酞(n-butylphthalide,NBP)是一種由芹菜籽揮發油中分離出的左旋體經人工合成的消旋體化合物,目前已應用于缺血性卒中的治療[4]。先前的研究表明,正丁基苯酞通過減少氧化應激、抑制炎癥等多種機制在腦保護中發揮重要作用[5]。此外,正丁基苯酞還通過抗氧化和抗線粒體細胞凋亡對心肌缺血再灌注損傷發揮心臟保護作用[6]。推測在心力衰竭后,應用正丁基苯酞可能通過其抗炎、抗氧化等作用抑制心房結構重塑和房顫形成,從而發揮心臟保護作用。因此,本研究通過觀察正丁基苯酞對心力衰竭大鼠心房結構重塑和房顫形成的影響,揭示其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

7-8周齡雄性Wistar大鼠90只,無特定病原體(SPF),平均體質量為(265.4±13.6)g,購自西安交通大學醫學院醫學實驗動物中心[許可證號:SYXK(陜)2018-001]。飼養環境溫度為3 ℃、相對濕度為55%,12 h光照/黑暗循環。飼養期間用純凈水和標準大鼠飼料飼養大鼠(南通特洛菲飼料科技有限公司),不限制飲食。

1.2 動物分組

將90只雄性Wistar大鼠隨機分為3組,即正丁基苯酞組、模型組和假手術組,每組30只。將正丁基苯酞(石藥集團恩必普藥業有限公司)溶解在大豆油中制成濃度為30 mg/ml的正丁基苯酞溶液。正丁基苯酞組按照每天200 mg/kg體質量的劑量(2 ml)灌胃Wistar大鼠,模型組和假手術組用等量(2 ml)的大豆油灌胃,共給藥4周,每天1次。

1.3 心肌梗死后心力衰竭模型的建立

結扎Wistar大鼠左前降支冠狀動脈(LADCA)建立心肌梗死(myocardial infarction,MI)大鼠模型。腹膜內注射7%的水合氯醛(300 mg/kg)麻醉大鼠,氣管插管并與呼吸機連接。呼吸頻率為45次/min,潮氣量為30 ml/次。在第三和第四肋之間打開胸腔暴露心臟。于左心耳根部下方2 mm結扎LADCA。當LADCA區域由鮮紅變蒼白,并且心電圖顯示大鼠ST-T抬高超過50%,且持續時間超過30 min表明建模成功。然后,逐漸縫合胸腔。假手術組大鼠接受相同手術但未結扎左前降支冠狀動脈。建立心肌梗死模型后第7天,使用Visual Sonics Vevo?2100高分辨率小動物超聲成像系統超聲檢查大鼠心動圖。將大鼠麻醉,仰臥放置在實驗臺上,去除胸前毛發。建模后第7天及治療結束后1 d,采用M模式示蹤測量大鼠左心室收縮末期內徑(LVESD)、左心室舒張末期內徑(LVEDD)、左室射血分數(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)和左心房直徑(LAD)。當LVEF降低45%時表示心力衰竭大鼠模型建模成功。

1.4 房顫誘導測試

參考文獻[7]所述方法并做適當修改來誘導大鼠房顫。超聲心動圖檢查后,腹膜內注射3%的戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉大鼠。無創氣管插管,連接PowerLab生理記錄儀并記錄肢體導聯心電圖,將電極導管插入大鼠食管至左心房后壁用于記錄食管心電圖和房顫感應。測量起搏閾值后通過電刺激器以雙閾值、20 ms的周期長度、5 ms的脈沖寬度和30 s的刺激時間進行心房起搏。房顫定義為心電圖出現快速、不規則和混亂的房顫波,且持續時間超過5 s,起搏重復3次。如果房顫成功誘導至少一次并且持續時間超過5 s,則為房顫誘導成功。

1.5 Masson三色染色檢測心房組織纖維化

大鼠治療結束后1 d,分離心臟左心房組織并用鹽水沖洗,4%多聚甲醛固定,石蠟包埋制作4 μm厚切片。使用Masson三色染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)按照說明書檢測大鼠的左心房組織纖維化程度。

1.6 免疫組化檢測連接蛋白43(Cx43)的表達

將左心房組織切片脫蠟、水化，并在0.6%過氧化氫甲醇溶液中孵育30 min以阻斷內源性過氧化物酶。將切片與連接蛋白43(Cx43)(1 ∶2 000稀釋,英國Abcam公司)一抗過夜孵育。然后與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體(1 ∶1 000稀釋,英國Abcam公司)在37 ℃下孵育30 min。使用DAB顯色試劑盒(北京索來寶科技有限公司)進行顯色。隨機選擇5個視野進行陽性染色評分,陽性細胞數<5%為0分,5%-25%為1分,5%-25%為1分,26%-50%為2分,51%-75%為3分,>75%為4分。染色強度評分如下:未染色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,深棕色為3分。陽性細胞計數評分×染色強度評分為陽性染色評分。

1.7 蛋白質印跡分析大鼠左心房組織中collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、α-SMA、TNF-α、TGF-β1、NF-κB、Nrf2和HO-1的蛋白表達

使用RIPA裂解緩沖液(上海碧云天生物技術有限公司)裂解大鼠左心房組織。BCA蛋白質測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)用于測定蛋白質濃度。然后將等量的蛋白質樣品在10% SDS-PAGE上電泳并轉移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。將膜在WB封閉溶液(北京百奧萊博科技有限公司)中室溫封閉1 h,然后與collagen Ⅰ(1 ∶3 000稀釋)、collagen Ⅲ(1 ∶3 000稀釋)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA,1 ∶1 000稀釋)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α,1 ∶2 000稀釋)、抗腫瘤生長因子-β1(TGF-β1,1 ∶3 000稀釋)、核因子-κB(NF-κB,1 ∶1 500稀釋)、核因子E2相關因子2(Nrf2,1 ∶1 000稀釋)、血紅素加氧酶-1(HO-1,1 ∶2 000稀釋)和甘油醛糖磷酸脫氫酶(GAPDH,1 ∶3 000稀釋)4 ℃過夜孵育，抗體均購自Abcam公司。GAPDH作為內參。然后室溫下與相應二抗孵育1 h。使用增強型ECL化學發光檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)顯影。通過Image Lab 2.0定量分析條帶表達強度。

1.8 血清抗氧化能力分析

分別使用超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(WST-1法)、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒(可見光法)和丙二醛(MDA)測定試劑盒(TBA法)檢測大鼠血清抗氧化能力,所使用試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司。

1.9 統計學分析

使用SPSS 19.0軟件進行統計分析。所有數據表示為均數±標準差。單因素方差分析(ANOVA)或Kruskal-WallisH檢驗用于分析多組之間的數據差異,t檢驗用于分析兩組之間的數據差異。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 正丁基苯酞對心力衰竭大鼠心臟功能的影響

與模型組相比,正丁基苯酞組大鼠的LVFS和LVEF顯著升高,而LVEDD、LVESD和LAD顯著降低(P<0.05,見表1)。

表1 三組大鼠的心臟功能比較

2.2 正丁基苯酞對心力衰竭大鼠的房顫誘導率和持續時間的影響

正丁基苯酞組大鼠的房顫誘導率顯著低于模型組(43.32%±5.63%vs73.21%±11.07%,P<0.05)。正丁基苯酞組大鼠的房顫持續時間顯著低于模型組[(176.32±42.68)svs(465.43±75.97)s,P<0.05,見圖1]。

與假手術組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05圖1 三組大鼠房顫誘導率和持續時間的比較Figure 1 Comparison of atrial fibrillation induction rate and duration of rats among three groups

2.3 正丁基苯酞對心力衰竭大鼠心房纖維化和心肌細胞肥大的影響

模型組大鼠左心房嚴重纖維化,肌原纖維被嚴重破壞,心肌明顯肥大;正丁基苯酞組大鼠左心房的纖維化和心肌細胞肥大明顯減輕(見圖2)。Western blot結果顯示,模型組中纖維化相關指標collagen Ⅰ、collagenⅢ和α-SMA蛋白的表達水平顯著增加,而正丁基苯酞組collagen Ⅰ、collagenⅢ和α-SMA的蛋白表達水平顯著低于模型組(P<0.05,見圖3)。

圖2 Masson三色染色檢測大鼠左心房組織的纖維化Figure 2 Fibrosis in left atrial tissue of rats after different treatment by Masson trichrome staining

2.4 正丁基苯酞對心力衰竭大鼠心房縫隙連接重構的影響

免疫組化檢測結果顯示,與假手術組相比,模型組大鼠的Cx43的陽性染色評分顯著降低(6.21±0.81vs1.13±0.15,P<0.05)。與模型組相比,正丁基苯酞組大鼠的Cx43的陽性染色評分顯著升高(1.13±0.15vs4.20±0.55,P<0.05,見圖4)。

圖4 大鼠左心房組織的Cx43陽性表達情況Figure 4 Immunohistochemical staining of Cx43 positive expression in left atrial tissue of rats in each group

2.5 正丁基苯酞對心力衰竭大鼠心房組織炎癥反應和氧化應激的影響

與假手術組比較,模型組大鼠左心房組織的炎癥介質TNF-α、TGF-β1和NF-κB水平均顯著增加(P<0.05);正丁基苯酞組大鼠的上述指標水平均顯著低于模型組(P<0.05)。與假手術組相比,模型組大鼠的Nrf2及其下游抗氧化劑反應元件HO-1蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05);正丁基苯酞組Nrf2和HO-1蛋白表達水平均顯著高于模型組(P<0.05,見圖5)。

與假手術組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05圖5 大鼠左心房組織的TNF-α、TGF-β1、NF-κB、Nrf2和HO-1蛋白表達Figure 5 Expression of TNF-α, TGF-β1, NF-κB, Nrf2 and HO-1 proteins in left atrial tissue of rats

2.6 正丁基苯酞對心力衰竭大鼠的血清抗氧化能力的影響

與假手術組比較,模型組大鼠的血清SOD和CAT活性顯著降低,而MDA水平顯著升高(P<0.05)。正丁基苯酞組大鼠的SOD和CAT活性顯著高于模型組,而MDA水平顯著低于模型組(P<0.05,見圖6)。

3 討論

抑制心房結構重塑是房顫治療的主要目的之一[8]。目前,尚不清楚正丁基苯酞對心房結構重塑和房顫形成的影響。本研究顯示,正丁基苯酞治療可導致心力衰竭大鼠的LVFS和LVEF顯著升高,而LVEDD、LVESD和LAD顯著降低。表明正丁基苯酞可以預防心力衰竭引起的心臟功能障礙,并減少心室和心房擴張。此外,本研究還顯示正丁基苯酞可降低心力衰竭大鼠房顫的誘導性和持續時間。本研究結果提示正丁基苯酞可能是一種房顫治療的潛在藥物。

在心力衰竭過程中,嚴重的心房纖維化會產生異常的電生理特性,并最終導致房顫的發生[9]。還有研究顯示,EZH2抑制劑GSK126通過抑制AngⅡ誘導的心房擴大和纖維化降低了房顫易感性[10]。因此,抗纖維化治療在房顫的上游治療中占有重要地位。本研究表明,與假手術組相比,心力衰竭發生明顯的心房擴大、細胞肥大、纖維化和間隙連接重塑、房顫易感性增加。在其他研究中也顯示了類似的結果[11]。但是,正丁基苯酞治療可顯著降低心房結構重塑,這與房顫易感性降低有關。這些結果表明,正丁基苯酞可能是一種治療房顫相關纖維化的潛在新藥。心房纖維化的形成是由α-SMA標記的成纖維細胞過度增殖和細胞外基質成分(collagen Ⅰ、collagen Ⅲ等)過度沉積所引起的[12]。本研究顯示,正丁基苯酞治療顯著降低了心力衰竭大鼠的collagen Ⅰ、collagen Ⅲ和α-SMA的蛋白表達水平。盡管不確定正丁基苯酞對房顫成纖維細胞增殖的作用是直接還是間接,但上述結果表明,正丁基苯酞可抑制心力衰竭大鼠的心房間質纖維化和心肌細胞肥大。

在房顫發病過程中,間隙連接重塑是導致房顫和心律失常的重要原因。縫隙連接通道是心肌細胞間的主要連接方式,Cx43是縫隙連接通道的主要組成蛋白。多項研究表明,上調Cx43可有效阻止房顫的發病[13,14]。本研究表明,與假手術組相比,模型組的Cx43的陽性染色評分顯著降低。此外,Cx43的分布還受到纖維化的影響,因為纖維化可能會破壞與正常Cx43組織相關的細胞骨架網絡和黏附蛋白[14]。因此,減少心房間質纖維化可能有益于糾正Cx43的表達和分布。本研究顯示,與模型組相比,正丁基苯酞組的Cx43的陽性染色評分顯著升高。這些數據進一步說明,正丁基苯酞預防房顫的機制與改善間隙連接重塑有關。

眾所周知,氧化應激和炎癥涉及心房電和結構重塑。活性氧(ROS)的增加直接損害心房肌細胞和離子通道。此外,升高的ROS還可以激活RAAS并促進促炎性介質的合成和分泌(包括TGF-β1、TNF-α和NF-κB),從而增加心房肌成纖維細胞的增殖并促進膠原沉積[8]。因此,抗氧化和抗炎治療是房顫上游治療的重要方面。先前的研究表明,NF-κB可以直接調節與炎癥反應有關的基因表達,增強包括TNF-α在內的多種炎性細胞因子的轉錄,并逐漸導致纖維化程度升高[15]。有研究證實TNF-α、NF-κB、TGF-β1的激活與糖尿病相關房顫的形成有關[16]。然而,TNF-α、NF-κB、TGF-β1的下調阻止了心房重構并抑制了房顫的進展[17]。這些數據表明,炎癥因子NF-α、NF-κB、TGF-β1在房顫的發展中起著重要作用。在心肌梗死、缺血性中風、阿爾茨海默氏病、糖尿病和帕金森氏病等疾病中,正丁基苯酞也增加了血清的抗氧化能力[6],表明正丁基苯酞具有很強的抗氧化特性和器官保護作用,因此其可能有助于房顫的預防和治療。本研究顯示,模型組大鼠左心房組織的炎癥介質TNF-α、TGF-β1和NF-κB水平均顯著增加,而正丁基苯酞組的上述指標水平均顯著低于模型組。

Nrf2是最重要的轉錄因子之一,Nrf2的激活可以啟動多種抗ROS的抗氧化反應元件(ARE)基因及其下游基因的表達,其中包括血紅素氧合酶1(HO-1)。據報道,Nrf2在房顫發生中起重要作用,Nrf2下調可導致氧化應激、心肌細胞肥大和纖維化增加,從而引起房顫[17]。相反,他汀類藥物對Nrf2/HO-1通路的激活抑制了心房速搏引起的心房結構重塑[18]。這些數據表明,Nrf2/HO-1途徑在房顫發生中具有保護作用。先前的研究表明正丁基苯酞是一種強抗氧化劑。通過Nrf2/HO-1等多種途徑在多種疾病中發揮抗氧化作用[5]。本研究顯示,與假手術組相比,模型組的Nrf2及HO-1蛋白表達水平均顯著降低,而正丁基苯酞組Nrf2和HO-1蛋白表達水平均顯著高于模型組。此外,正丁基苯酞治療顯著升高了SOD和CAT活性,而降低了MDA水平。表明正丁基苯酞可通過抑制炎癥反應和氧化應激來發揮房顫保護作用。先前的研究表明,心房中HO-1的激活可能會抑制TGF-β1對膠原纖維的上調[18]。因此,正丁基苯酞對炎癥因子的抑制和纖維化的抑制可能與Nrf2/HO-1的激活有關。

總之,本研究表明,正丁基苯酞可有效降低心力衰竭大鼠的房顫易感性和持續時間,提高心臟功能,抑制心房結構重塑和纖維化,其作用機制與抑制TNF-α、NF-κB、TGF-β1等炎癥因子表達、改善間隙連接重塑及激活Nrf2/HO-1介導的抗氧化活性有關。因此,正丁基苯酞有望成為房顫預防和治療的上游治療藥物。