內質網應激-miR-105-RyR2信號通路參與房顫發生的機制研究

胡 蘇,李博濤,王軍奎,趙 娜*

(1西安醫學院附屬陜西省人民醫院心內一科,西安 710068;2陜西省人民醫院心內一科;*通訊作者,E-mail:dr.zhaona@qq.com)

伴隨人口老齡化,心房顫動(atrial fibrillation,AF)患病率逐年增高,據GBD(global burden of disease)數據庫統計,截止2017年,全球約有3 760萬人口罹患房顫,房顫導致的危害主要包括心力衰竭、缺血性腦卒中及體循環栓塞,伴隨致殘及致死風險增高[1]。關于房顫的發生機制目前尚未完全清楚,局灶異位電活動觸發是目前導致房顫的公認學說之一[2]。

內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是指細胞在受到氧化應激、缺血再灌注損傷、能量代謝障礙等刺激因素時發生的自我保護機制,ERS激活伴隨葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)表達顯著上調,GRP78作為內質網應激時高度保守的伴侶蛋白,可以用來評估ERS是否活化[3-5]。持續過度的ERS活化將導致細胞內環境穩態失衡、鈣離子(Ca2+)平衡紊亂,最終影響細胞功能[6]。鈣離子的瞬間釋放是誘發心肌細胞異位電活動觸發的重要誘因[7]。具體過程如下:心肌細胞膜L型Ca2+通道激活,少量Ca2+進入心肌細胞內,觸發內質網上雷尼丁受體2(ryanodine receptor 2,RyR2)表達增加并磷酸化增加,磷酸化RyR2(phosphorylation RyR2,pS-RyR2)開放,釋放大量Ca2+進入胞質內,導致胞質內Ca2+濃度瞬時增加,形成鈣火花,誘發異位電活動,成為各種心律失常基礎[7-9]。既往文獻[10]提示RyR2磷酸化位點主要包括RyR2絲氨酸(serine,Ser)Ser2808、Ser2809、Ser2814、Ser2815、Ser2830、Ser2845等氨基酸殘基段,其中Ser2808及Ser2814的磷酸化能顯著促進RyR2通道開放而加強鈣火花頻率。

內質網應激激活是否參與房顫的發生及其具體機制尚未有研究報道。本研究旨在探索內質網應激是否參與到房顫的發生，及是否通過影響異位觸發灶電活動過程參與房顫的發生。

1 材料與方法

1.1 房顫動物模型制作

將20只8周齡雄性SD大鼠(SPF級,西安交通大學動物實驗中心,體質量185.86 g±6.53 g)隨機分為房顫組和對照組,每組10只。參考文獻[11,12],采用經食道高頻電刺激快速心房起搏誘導大鼠房顫發作。實驗過程中,房顫組大鼠采用戊巴比妥(50 mg/kg,腹腔內注射)進行麻醉,密切關注大鼠情況,避免麻醉過量或不足;取仰臥位固定,四肢皮下描記大鼠標準Ⅱ導聯心電圖記錄(BL-420F生物機能系統,成都泰盟);頸胸部備皮,沿正中線切開皮膚,鈍性分離肌肉組織,暴露氣管,利用自制氣管插管行氣管插管術維持大鼠呼吸,必要時使用小動物呼吸機(TKR-200C江西特力)輔助呼吸;經大鼠口插入起搏電極(蘇州電子儀器廠,規格:頭端2個直徑2 mm的環狀電極,電極間隔2 mm),深度約為7 cm,保持起搏電極前端自然彎曲緊貼左心房,根據心房心電圖捕獲情況適時調整電極深度,尾端連接生理、藥理電子刺激儀(YLS-9A,北京眾實)高頻電刺激經食道快速心房起搏誘導大鼠房顫發作。刺激參數具體如下:①刺激波形為方形波,連續波輸出;②脈沖寬度6 ms,間隙20 ms;③刺激頻率約1 200次/min;④電壓20 V,電流2 mA;⑤刺激時間:第1天,30 s/次,間隔5 min/次,每天5次/組,第4天行第2輪刺激。⑥大鼠房顫穩定發作7 d以上。對照組除不進行心房起搏外,其余步驟同房顫組。大鼠房顫穩定發作,判讀房顫發作時心電圖:正常心房P波消失,f波出現,中間無等電位線,心室率較前明顯加快。

1.2 大鼠心房肌細胞分離、乳大鼠心肌細胞分離及轉染

深度麻醉,開胸取出房顫組及對照組大鼠心臟,參考既往文獻[13]分離大鼠心房肌細胞:①分別分離兩組大鼠心房肌組織棄去其他組織,生理鹽水洗凈后置于4 ℃ D-Hank’s液中反復沖洗3次。②將心房肌組織用眼科剪剪成1 mm2大小組織塊,胰蛋白酶溶液(0.1% 10 ml)37 ℃水浴8 min,棄去上層混懸液。③膠原酶溶液(0.1% 15 ml)37 ℃水浴并攪拌35 min,吸取上層混懸液,置于預冷10% DMEM中終止反應。④所得沉淀物加入膠原酶溶液(0.1% 15 ml)37 ℃水浴并攪拌35 min,吸取全部液體,終止反應,所得混懸液用300目濾網濾過除去未消化組織,室溫下800 r/min離心3-5 min,棄去上清液,于沉淀中加入培養液2 ml混勻,所得心房肌細胞留待備用。⑤取對照組大鼠心房肌細胞在無血清的DMEM培養基中培養12 h,應用衣霉素(tunicamycin,100 ng/ml)處理孵育48 h建立衣霉素誘導的心房肌細胞ERS模型[14],設立衣霉素組。

主要試劑:①D-Hank’s液(NaCl 8.0 g/L,KCl 0.4 g/L,Na2HPO40.7 g/L,H2O 0.06 g/L,KH2PO40.06 g/L,NaHCO30.35 g/L),使用雙蒸去離子水配制,調整pH=7.2,高壓蒸氣滅菌后4 ℃保存備用;②培養液(10% DMEM干粉+雙蒸去離子水配置液體)調整pH=7.2-7.4,正壓過濾除菌后-20 ℃保存備用。

乳大鼠心肌細胞取自出生1-2 d的新生SD大鼠[12]。①從劍突下沿著胸骨剪開乳大鼠胸廓,暴露心臟后,沿心底剪下心臟。②將心肌剪碎呈小片狀,然后應用1 mg/ml胰蛋白酶消化5次,5 min/次。③收集除外第1次消化的細胞懸液,加入含有胎牛血清的DMEM培養液終止消化,室溫下,1 000 r/min離心10 min,去掉上清,重新混懸于含有100 ml/L(V/V)胎牛血清,添加100 U/ml青霉素,100 mg/ml鏈霉素的DMEM培養液中,重新種植于6孔板,差速貼壁1 h后,加入100 μmol/L的5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,Brdu)。④待心肌細胞穩定后,在無血清的DMEM培養基中培養12 h,應用衣霉素(tunicamycin,100 ng/ml)處理孵育48 h建立衣霉素誘導的乳大鼠心肌細胞ERS模型[14],在此基礎上轉染miR-105mimic及mimic NC(negative control)(GenePharma)過表達miR-105作為衣霉素+miR-105 mimic組及衣霉素+mimic NC組,同時乳大鼠心肌細胞分別轉染miR-105 mimic及mimic NC設立對照+miR-105 mimic組及對照+mimic NC組。

1.3 Western blot檢測GRP78、RyR2蛋白及其磷酸化RyR2蛋白表達

應用RIPA裂解液,添加苯甲基磺酰氟(PMSF,1 mmol/L)提取組織或細胞總蛋白。蛋白濃度定量采用BCA蛋白定量法。應用100 g/L SDS聚丙烯酰胺凝膠分離,轉移至硝酸纖維素膜,在50 g/L脫脂牛奶中封閉1 h,滴加抗葡萄糖調節蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)抗體(1 ∶500, Ab21685, Abcam),抗雷尼丁受體2(ryanodine receptor2,RyR2)抗體(1 ∶500,ABIN1874679,北京,中國),抗pS2814-雷尼丁受體2(phospho-serine 2814-ryanodine receptor2,pS2814-RyR2)抗體(1 ∶500,ABIN2707001,北京,中國),抗pS2808-雷尼丁受體2(phospho-serine 2808-ryanodine receptor2,pS2808-RyR2)抗體(1 ∶500,ABIN2707001,北京,中國),滴加抗甘油酸-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(1 ∶1 000, AB-P-R 001,Good Here,杭州,中國)抗體,4 ℃過夜。洗膜后,室溫下,采用辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG二抗(1 ∶1 000)孵育1 h。采用化學發光法使條帶顯影,顯影圖像利用吸光度法定量,GAPDH蛋白水平用作內參校正蛋白。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)檢測RyR2 mRNA、miR-105

組織或細胞中的RNA應用TRIzol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA),參照試劑盒說明方法提取。PCR產物通過SYBR-green檢測試劑盒由ABI PRISM 7700序列檢測系統(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)進行半定量檢測。β-actin mRNA、U6分別作為RyR2 mRNA、miR-105內參標準。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 生物信息學預測

應用Targetscan數據庫預測篩選出與RyR2 mRNA 3′非翻譯區(3′-untranslation region,3′-UTR)存在結合位點的高度保守的mRNAs。

1.6 統計學分析

實驗數據均采用SPSS 16.0進行統計學分析,計數資料以均數±標準差表示,根據情況選Student-t或單因素方差分析并Bonferroni后檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 房顫大鼠內質網應激活化伴隨雷尼丁受體2活性增加

大鼠ECG檢查提示房顫組大鼠模型成功建立(見圖1)。與對照組比較,房顫組心房心肌組織GRP78蛋白水平表達上調(P<0.05,見圖2),提示房顫大鼠內質網應激活化。與對照組比較,房顫組RyR2 mRNA,RyR2蛋白,pS2814-RyR2及pS2808-RyR2蛋白水平表達均上調(均P<0.05,見圖3)。

圖1 房顫大鼠心電圖Figure 1 Electrocardiogram of atrial fibrillationrats

2.2 生物信息學預測與RyR2結合的miRNA及其表達變化

為進一步探索內質網應激在房顫發生中參與的機制,應用生物信息學預測發現miR-105與RyR2 3′UTR區域存在結合位點(見圖4)。應用real-time PCR檢測發現,與對照組比較,房顫組miR-105表達下調(P<0.05,見圖5)。

與對照組相比,*P<0.05圖2 各組大鼠心房肌組織GRP78表達Figure 2 Expression of GRP78 protein in atrial tissuesin all groups

與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01圖3 房顫大鼠心房肌細胞RyR2 mRNA、RyR2蛋白及其磷酸化表達Figure 3 Expression of RyR2 mRNA,RyR2 and phosphorylated RyR2 proteins in atrial tissue of atrial fibrillationrats

圖4 生物信息學方法預測大鼠miR-105與RyR2 3′UTR存在結合位點Figure 4 Bioinformatic analysis predicts miR-105is bound with RyR2 3′UTR in rats

與對照組相比,*P<0.05圖5 房顫大鼠心房肌細胞miR-105表達Figure 5 Expression of miR-105 in atrial myocytes of atrial fibrillationrats

2.3 細胞水平內質網應激模型miR-105表達下調伴隨RyR2活性增加

使用衣霉素誘導大鼠心房肌細胞建立細胞水平內質網應激模型,與對照組比較,衣霉素組及房顫組大鼠心房肌細胞組織GRP78表達均上調(均P<0.01,見圖6),提示內質網應激均活化;與房顫組比較,衣霉素組GRP78表達無統計學差異(P>0.05,見圖6)。應用real-time PCR檢測發現,與對照組比較,衣霉素組及房顫組miR-105表達水平均下調(均P<0.01,見圖7),RyR2 mRNA表達水平均上調(均P<0.05,見圖8)。與對照組比較,衣霉素組及房顫組大鼠心房肌細胞組織RyR2,pS2814-RyR2及pS2808-RyR2蛋白水平均表達上調(均P<0.001,見圖9)。與房顫組比較,衣霉素組miR-105、RyR2 mRNA表達,RyR2、pS2814-RyR2及pS2808-RyR2蛋白水平無明顯統計學差異(P>0.05,見圖7-9)。

與對照組相比,**P<0.01,***P<0.001圖6 各組GRP78表達水平Figure 6 Expression of GRP78 in all groups

與對照組相比,**P<0.01圖7 各組miR-105表達水平Figure 7 Expression of miR-105 in all groups

與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01圖8 各組RyR2 mRNA表達水平Figure 8 Expression of RyR2 mRNA in all groups

與對照組相比,***P<0.001圖9 各組RyR2蛋白及其磷酸化表達水平Figure 9 Expression of RyR2 and phosphorylated RyR2 proteins in all groups

2.4 內質網應激激活后通過miR-105調控RyR2表達

與對照+mimic NC組相比,衣霉素+mimic NC組乳大鼠心肌細胞經衣霉素刺激后GRP78表達水平上調(P<0.01,見圖10),提示內質網應激激活。于此基礎上轉染miR-105,與衣霉素+mimic NC組比較,衣霉素+miR-105 mimic組miR-105表達水平上調(均P<0.01,見圖11);與衣霉素+mimic NC組比較,衣霉素+miR-105 mimic組GRP78蛋白水平表達無變化(P<0.05,見圖10)。與衣霉素+mimic NC組比較,衣霉素+miR-105 mimic組RyR2、pS2814-RyR2及pS2808-RyR2蛋白水平表達均下調(均P<0.05,見圖12)。

與對照+mimic NC組相比,**P<0.01;與衣霉素+mimicNC組相比,#P<0.05圖10 各組GRP78蛋白表達水平Figure 10 Expression of GRP78 protein in all groups

與對照+mimic NC組相比,**P<0.01;與衣霉素+mimic NC組相比,###P<0.01圖11 各組miR-105表達水平Figure 11 Expression of miR-105 in all groups

3 討論

心房顫動所帶來的高致殘率及致死率儼然增添了社會醫療和經濟負擔[15],患者的生活質量受到影響。關于房顫觸發及維持的發病機制還不明確[1],臨床上治療房顫仍面對諸多困惑。

與對照組+mimic NC組相比,*P<0.05,**P<0.01;與衣霉素+mimic NC組相比,#P<0.05,##P<0.01圖12 各組RyR2 mRNA,RyR2蛋白及其磷酸化表達水平Figure 12 Expression of RyR2 mRNA,RyR2 and phosphorylated RyR2 proteins in all groups

肺靜脈異常電活動觸發房顫是目前公認的重要機制之一[2,16],對于房顫維持機制的假說主要包括多發子波折返、局灶激動、轉子樣激動[17-19]等。心房重構、自主神經系統作用、遺傳因素、腎素-血管緊張素-醛固酮系統活性增高、心房肌炎性細胞浸潤以及氧化應激[1,20,21]等在房顫的發生及維持中均發揮重要調控作用。內質網應激激活是否參與房顫發生及其具體機制尚未有研究報道。

本研究發現房顫GRP78表達水平上調,內質網應激活化,RyR2受體及pS2814-RyR2及pS2808-RyR2蛋白水平亦顯著上調。既往研究[22]提示,離子穩態失衡、藥物及細胞內氧合功能障礙等因素通過作用于cAMP依賴的蛋白激酶A(cAMP-depen-dent protein kinase A,PKA)、鈣調蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ(calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ)使RyR2受體磷酸化增加后,與其緊密結合的通道穩定蛋白Calstabin2(FKBP12.6)相解離,RyR2通道開放增加,鈣觸發鈣釋放增強,RyR2受體過度磷酸化,Ca2+超負荷形成內向瞬態電流,導致心肌細胞延遲后除極(depolarization after delay,DAD),進而引發心律失常[7]。上述結果提示內質網應激活化參與房顫發生。

為了進一步探索內質網應激參與房顫發生的機制,應用Targetscan數據庫預測篩選出高度保守的miR-105與RyR2 mRNA 3′-UTR存在結合位點。本實驗進一步發現房顫或應用衣霉素激活導致內質網應激活化后miR-105表達下調,同時RyR2mRNA,RyR2、pS2814-RyR2及pS2808-RyR2蛋白水平均表達上調,推測miR-105-RyR2通路參與到內質網激活所致房顫發生的病理生理過程。

為進一步證實內質網應激激活通過miR-105發揮調控作用,利用衣霉素誘導細胞水平內質網應激激活后,進一步于乳大鼠心肌細胞過表達miR-105,發現RyR2mRNA、RyR2、pS2814-RyR2及pS2808-RyR2蛋白水平表達均顯著下調,上述結果提示,內質網應激激活后通過miR-105參與調控RyR2及其磷酸化水平,提示內質網應激激活后通過miR-105參與房顫發生。本研究中所檢測的兩個RyR2磷酸化位點Ser2808、Ser2814其蛋白水平于內質網應激激活后表達上調,結果提示Ser2808、Ser2814可能是miR-105參與房顫發生的主要位點,同時提示PKA或CaMKⅡ可能參與房顫發生的具體研究,但具體機制仍需進一步研究。

本研究顯示長期內質網應激激活,使得磷酸化RyR2水平顯著增加,誘發肺靜脈心房肌細胞內舒張期鈣離子失平衡,觸發局灶異位電活動促使房顫發生,證實內質網應激參與房顫發生,同時miR-105參與該機制。本研究推測ERS-miR-105-RyR2信號途徑參與房顫的發生。未來將進一步明確RyR2是否系miR-105的直接調控靶蛋白,并致力于進一步探究房顫后內質網應激活化其他相關上下游信號通路,為揭示房顫發生的病理生理機制及藥物防治提供新的理論線索。