鳶尾素對高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞TRPV4表達及增殖遷移的影響

焦 楊,季利芬,史靜怡

(1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科,西安 710004;2中國人民解放軍陸軍第七十三集團軍醫(yī)院藥劑科;3西北大學(xué)附屬醫(yī)院西安市第三醫(yī)院心內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:2642963758@qq.com)

糖尿病在我國發(fā)病率逐年增高,其心、腦、腎等血管并發(fā)癥是造成患者殘疾、死亡的主要原因。血管內(nèi)皮損傷及功能障礙是糖尿病血管并發(fā)癥的早期病理、生理改變,同時也是最重要的發(fā)病機制,可能進一步誘發(fā)并加重其他心血管疾病的風(fēng)險[1]。研究發(fā)現(xiàn),高糖能夠抑制血管內(nèi)皮細胞生長,誘發(fā)內(nèi)皮細胞凋亡,引起內(nèi)皮細胞損傷[2]。鳶尾素是一種由骨骼肌、脂肪等組織合成、分泌的多肽類激素,運動能夠增加其產(chǎn)生水平[3]。研究表明,糖尿病患者血清鳶尾素水平降低,與胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)有關(guān),可能影響微血管和大血管并發(fā)癥[4,5]。但是,鳶尾素影響高糖狀態(tài)下的血管內(nèi)皮細胞損傷機制尚未完全闡明。瞬時受體電位-香草素受體4(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)是一種非選擇性陽離子通道,參與腫瘤細胞增殖、遷移及血管生成等途徑的調(diào)控[6,7]。本研究將通過研究鳶尾素對高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中TRPV4表達及增殖、遷移的影響,以期為糖尿病血管并發(fā)癥的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

HUVECs(貨號:FB0017)購自美國ATCC細胞庫;DMEM培養(yǎng)基(貨號:KL-P0032)購自德國Merck/Sigma公司;鳶尾素(貨號:E-12757)購自上海赫果生物科技有限公司;CCK-8試劑(貨號:CK-04)購自日本同仁化學(xué)研究所;Annexin Ⅴ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(貨號:S0185)購自哈爾濱新海基因檢測有限公司;TRPV4抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase,MMP-9)抗體、GAPDH抗體(貨號:ab219192、ab38898、ab181602)購自Abcam公司;血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)抗體(貨號:251901)購自美國Abbiotec公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔(貨號:0295G-HRP)購自美國Santa公司;流式細胞儀(型號:BD FACSCanto II)購自美國BD公司;光學(xué)顯微鏡(型號:CX31)購自日本Olympus公司;全自動酶標(biāo)儀(型號:MODEL550)、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(型號:ChemiDocXRS)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 取HUVECs細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞融合率達到75%左右時,用胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。

取對數(shù)期HUVECs細胞以5×105個/ml、100 μl/孔接種于96孔培養(yǎng)板中,分為5組:對照組(5 mmol/L葡萄糖)、高糖組(30 mmol/L葡萄糖)、0.1 μg/ml鳶尾素+高糖組(0.1 μg/ml鳶尾素+30 mmol/L葡萄糖)、1 μg/ml鳶尾素+高糖組(1 μg/ml鳶尾素+30 mmol/L葡萄糖)和3 μg/ml鳶尾素+高糖組(3 μg/ml鳶尾素+30 mmol/L葡萄糖)。本研究經(jīng)西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2.2 CCK-8法檢測各組HUVECs細胞增殖情況 按照1.2.1分組處理HUVECs細胞,于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h后每孔加入10 μl CCK-8試劑,培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h,使用全自動酶標(biāo)儀于波長450 nm處檢測各孔的吸光度(optical density,OD)值。

1.2.3 流式細胞儀檢測各組HUVECs細胞凋亡情況 按照1.2.1分組處理HUVECs細胞,培養(yǎng)48 h后收集細胞,用胰蛋白酶消化、PBS洗滌細胞,使用400 μl 1×結(jié)合緩沖液將細胞調(diào)整為1×106個/ml的細胞懸浮液,加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC于室溫避光條件下孵育15 min,加入10 μl PI染色液繼續(xù)避光孵育5 min,使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4 Transwell法檢測各組HUVECs細胞遷移情況 按照1.2.1分組處理HUVECs細胞,使用無血清培養(yǎng)液將各組HUVECs細胞稀釋為2.5×105個/ml的細胞懸液,并取200 μl加入Transwell小室上層,取500 μl 10%胎牛血清的培養(yǎng)液加入Transwell小室下室,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h取出,用無菌棉簽小心擦去未穿膜的細胞,用4%多聚甲醛溶液固定下層遷移細胞10 min,PBS洗滌后用0.5%結(jié)晶紫染液染色20 min,PBS洗滌。倒置在光學(xué)顯微鏡下,200倍鏡下隨機選取6個視野觀察,統(tǒng)計每個視野中的遷移細胞數(shù)并計算平均值。

1.2.5 蛋白印跡(Western blot)法檢測各組HUVECs細胞中TRPV4、VEGF、MMP-9蛋白表達情況 按照1.2.1分組處理HUVECs細胞,培養(yǎng)48 h后收集細胞,使用細胞裂解液提取各組細胞總蛋白,使用BCA法測定蛋白濃度并進行定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)至PDVF膜上,用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h,分別加入TRPV4抗體(1 ∶500)、VEGF抗體(1 ∶500)、MMP-9抗體(1 ∶500)、GAPDH抗體(1 ∶500)4 ℃孵育過夜,TBST洗滌3次后,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h,TBST洗滌3次后免疫反應(yīng)化學(xué)發(fā)光法顯色,Tanon 600圖像分析系統(tǒng)拍攝圖像并分析條帶灰度,目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組HUVECs細胞增殖情況

與對照組相比,高糖組HUVECs細胞OD值顯著降低(P<0.05);與高糖組相比,0.1,1,3 μg/ml鳶尾素+高糖組HUVECs細胞OD值顯著升高(P<0.05);隨著鳶尾素處理濃度升高,HUVECs細胞OD值逐漸升高(P<0.05,見表1)。

表1 各組HUVECs細胞OD值、凋亡率比較

2.2 各組HUVECs細胞凋亡情況

與對照組相比,高糖組HUVECs細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與高糖組相比,0.1,1,3 μg/ml鳶尾素+高糖組HUVECs細胞凋亡率顯著降低(P<0.05);隨著鳶尾素處理濃度升高,HUVECs細胞凋亡率逐漸降低(P<0.05,見圖1、表1)。

圖1 各組HUVECs細胞凋亡情況Figure 1 Apoptosis of HUVECs cells in each group

2.3 各組HUVECs細胞遷移情況

與對照組相比,高糖組HUVECs細胞遷移細胞數(shù)顯著降低(P<0.05);與高糖組相比,0.1、1、3 μg/ml鳶尾素+高糖組HUVECs細胞遷移細胞數(shù)顯著升高(P<0.05);隨著鳶尾素處理濃度升高,HUVECs細胞遷移細胞數(shù)逐漸升高(P<0.05,見圖2、表2)。

圖2 各組HUVECs細胞遷移情況Figure 2 Migration of HUVECs in each groups

表2 各組HUVECs細胞遷移細胞數(shù)比較

2.4 各組HUVECs細胞中TRPV4、VEGF、MMP-9蛋白表達情況

與對照組相比,高糖組HUVECs細胞中TRPV4、VEGF、MMP-9蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05);與高糖組相比,0.1、1、3 μg/ml鳶尾素+高糖組HUVECs細胞中TRPV4、VEGF、MMP-9蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05);隨著鳶尾素處理濃度升高,HUVECs細胞中TRPV4、VEGF、MMP-9蛋白表達水平均逐漸升高(P<0.05,見圖3、表3)。

圖3 各組HUVECs細胞中TRPV4、VEGF、MMP-9蛋白的表達Figure 3 The expression of TRPV4, VEGF, MMP-9 proteins in HUVECs in each group

表3 各組HUVECs細胞中TRPV4、VEGF、MMP-9蛋白表達水平比較

3 討論

血管內(nèi)皮細胞是覆于血管內(nèi)膜的一群細胞,代謝活躍,且與大量血管活性物質(zhì)合成和分泌有關(guān),在調(diào)節(jié)血流張力、血管速度及氧化應(yīng)激、抑制血管炎癥等血管正常生理功能及血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的維持方面發(fā)揮重要作用[8,9]。隨著糖尿病發(fā)病率不斷升高,由高血糖引起的糖尿病心血管病變、視網(wǎng)膜病變等多種并發(fā)癥的發(fā)病率亦不斷升高,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[10]。高血糖引起的血管內(nèi)皮細胞凋亡加速、分泌因子失衡等血管內(nèi)皮細胞功能損傷是導(dǎo)致糖尿病患者并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要病理生理機制[11]。因此,高糖環(huán)境下減少血管內(nèi)皮細胞損傷對于減少糖尿病患者并發(fā)癥具有重要意義。

鳶尾素是由Ⅲ型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白5經(jīng)蛋白水解酶剪切后形成的多肽片段,由112個氨基酸殘基多肽片段組成,是一種與運動相關(guān)的、可調(diào)節(jié)糖脂代謝的新型肌肉因子,具有改善胰島素抵抗、促進白色脂肪棕色化、減輕體重等作用,是很具前景的代謝性疾病防治靶點,在糖尿病、肥胖等代謝性疾病、骨生成及慢性腎病方面發(fā)揮功能[12,13]。朱迪等[14]研究發(fā)現(xiàn),鳶尾素可能通過抑制氧化應(yīng)激減輕高糖/高脂誘導(dǎo)的HUVECs損傷,發(fā)揮內(nèi)皮保護作用。盧俊顏等[15]研究表明,鳶尾素可能通過激活3-磷酸磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B/內(nèi)皮型一氧化氮合酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,抑制高糖誘導(dǎo)的HUVECs氧化應(yīng)激和凋亡,具有潛在的防治糖尿病血管并發(fā)癥的臨床價值。本研究使用高糖誘導(dǎo)HUVECs,結(jié)果顯示,HUVECs細胞OD值、遷移細胞數(shù)顯著降低,細胞凋亡率顯著升高,表明高糖損壞了HUVECs細胞的正常增殖、遷移功能。進一步使用鳶尾素處理高糖環(huán)境中的HUVECs細胞發(fā)現(xiàn),HUVECs細胞OD值、遷移細胞數(shù)顯著升高,細胞凋亡率顯著降低,提示鳶尾素可以減輕高糖對HUVECs細胞增殖、遷移功能的抑制作用,同時減少凋亡,且隨著鳶尾素處理濃度升高,高糖對HUVECs細胞增殖、凋亡、遷移的影響逐漸減輕。

瞬時受體電位(transient receptor potential,TRP)通道是一系列非選擇性的陽離子通道,能夠在細胞內(nèi)外環(huán)境的刺激下激活,參與機體各種重要的生理、病理過程[16]。TRPV4是TRP亞族成員,在腫瘤的增殖、遷移及血管生成等途徑中發(fā)揮重要作用[17]。胡文霞等[18]研究表明,TRPV4通道在小鼠腦血管內(nèi)皮細胞中顯著高表達,可能在調(diào)節(jié)腦血管內(nèi)皮功能中具有重要意義。VEGF是血管內(nèi)皮細胞生長因子,與血管內(nèi)皮細胞增殖密切相關(guān)[19]。MMP-9是鋅離子依賴的蛋白水解酶家族MMP家族成員,在腫瘤細胞侵襲中發(fā)揮重要作用[20]。本研究結(jié)果顯示,與對照組相比,高糖組HUVECs細胞中TRPV4、VEGF、MMP-9蛋白表達水平均顯著降低,提示TRPV4、VEGF、MMP-9可能參與高糖抑制HUVECs細胞增殖、遷移并誘導(dǎo)其凋亡的過程。進一步使用鳶尾素處理高糖環(huán)境中的HUVECs細胞發(fā)現(xiàn),HUVECs細胞中TRPV4、VEGF、MMP-9蛋白表達水平均顯著升高,且隨著鳶尾素處理濃度升高,HUVECs細胞中TRPV4、VEGF、MMP-9蛋白表達水平均逐漸升高,提示鳶尾素減輕高糖對HUVECs細胞增殖、凋亡、遷移功能的影響,可能與促進TRPV4表達有關(guān)。

綜上所述,鳶尾素可以減輕高糖對HUVECs細胞增殖、遷移的抑制作用及對HUVECs細胞凋亡的促進作用,即減少高糖誘導(dǎo)的HUVECs細胞損傷,可能與促進TRPV4蛋白表達有關(guān)。因而,鳶尾素在減少糖尿病患者血管內(nèi)皮細胞損傷,降低血管并發(fā)癥發(fā)病率方面具有潛在價值,值得進一步研究。