長鏈非編碼RNA SNHG5在重度子癇前期患者胎盤中的表達及其通過miR-155/CXCR4對滋養細胞侵襲的影響

楊志娟,張 媛,彭迎春,許洪梅,楊 洋,師增增

(1樂山市人民醫院婦產科,樂山 614000;2西安醫學院第一附屬醫院婦產科;3空軍軍醫大學第二附屬醫院婦產科;*通訊作者,E-mail:87498009@qq.com)

子癇前期(preeclapmpsia,PE)是妊娠期常見特異性疾病,危及母兒安全[1],目前發病機制不清。PE時,由于滋養細胞增殖異常、侵襲障礙、凋亡增加,螺旋動脈重塑受損,引發后續病理性胎盤形成為主要學說[2]。PE是多因素、多機制及多通路引起的疾病;因此了解滋養細胞功能相關影響因素,對探究PE病因具有一定意義。

近年來的相關研究顯示,部分長鏈非編碼RNA(lncRNA)與PE相關,能夠調節滋養細胞的侵襲和遷移[3]。lncRNA為長度超過200 nt且不能編碼蛋白質的一類非編碼RNA(ncRNA),能夠參與細胞增殖、凋亡、血管生成和腫瘤轉移等過程,還可以多種方式調控同為ncRNA屬性的微小RNA(microRNA,miRNA),間接影響miRNA的靶基因發揮相關生理功能[4]。其中,lncRNA-SNHG5在黑色素瘤細胞中能夠通過對miR-155發揮競爭性內源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)作用,促進細胞增殖,抑制凋亡[5]。而miR-155與PE的相關性研究已較為深入,其在PE胎盤組織中病理性高表達[6];其靶基因CXCR4[7]在PE胎盤中病理性低表達,且能夠影響滋養細胞侵襲性[8]。

因此,lncRNA-SNHG5是否與PE相關,該因子作為上游因子能否對miR-155發揮競爭性內源性RNA作用,改變miR-155的表達,抑制靶基因CXCR4從而減弱滋養細胞侵襲功能,參與PE的發病,值得探究。通過本研究,希望可以初步探索PE的發病機制,為臨床對PE進行診斷或治療提供理論基礎;對患者、醫療機構及社會具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 胎盤組織采集

30例重度子癇前期(sPE組)與30例正常產婦(正常組)胎盤組織均收集自2018年10月至2019年6月于樂山市人民醫院婦產科住院首次接受剖宮產分娩的患者。納入標準:所納入的兩組產婦既往均無糖尿病、心臟病、慢性高血壓、慢性腎炎、自身免疫疾病、血栓形成病癥、精神疾病、陰道或剖宮產分娩史、胎兒畸形和HELLP綜合征病史。sPE組按照第九版婦產科學診斷標準確診為重度子癇前期的患者。

用滅菌PBS洗滌胎盤組織,立即在液氮中快速冷凍,在-80 ℃下儲存備用。所有實驗均經樂山市人民醫院倫理委員會批準。所有納入產婦均簽署知情同意書。

1.2 細胞株及主要試劑

HTR8細胞購自美國ATCC公司。RPMI-1640培養基、胎牛血清(FBS)購自美國Thermo公司;空質粒(pcDNA3.1)和SNHG5過表達質粒(pcDNA3.1-SNHG5)購自中國上海吉瑪公司;siRNA(SNHG5抑制序列)、PCR引物購自中國廣州瑞博公司;TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司;PrimeScript RT Master Mix及PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒、SYBR Premix ExTaq試劑盒購自日本TaKaRa公司;Opti-MEM培養液及Lipofectamine2000試劑盒購自美國Invitrogen公司;Matrigel膠、Tanswell小室購自美國BD公司;SDS裂解液及蛋白定量試劑盒購自美國Invitrogen公司;小鼠抗人CXCR4單克隆抗體、小鼠抗人GAPDH單克隆抗體、二抗購自英國Abcam公司。

1.3 細胞培養與轉染

常規復蘇HTR8細胞,接種于含10%胎牛血清,100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的RPMI-1640培養基,37 ℃、5% CO2無菌培養。取對數生長期HTR8細胞,按照Lipofectamine2000試劑盒說明書步驟,分別轉染空質粒(pcDNA3.1)、SNHG5過表達質粒(pcDNA3.1-SNHG5)、siRNA(SNHG5抑制序列),分為:過表達組、抑制組和對照組(NC組)。每組設置5孔重復。轉染后6 h,第一次細胞換液,培養24 h進行后續實驗。

1.4 qRT-PCR檢測胎盤組織lncRNA-SNHG5及轉染后HTR8細胞中lncRNA-SNHG5、miR-155、CXCR4 mRNA的表達

按照TRIzol試劑盒說明步驟提取凍存sPE組、正常組胎盤組織及各轉染組細胞總RNA,并檢測RNA質量。根據PrimerBank公布的基因序列設計合成lncRNA-SNHG5、miR-155、CXCR4及內參U6、β-actin的引物序列,具體序列見表1。

表1 目的基因引物序列及PCR反應條件

使用PrimeScript RT Master Mix反轉錄合成lncRNA-SNHG5、CXCR4cDNA。使用PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄合成MiR-155 cDNA。分別以U6、β-actin為內參,按照SYBR Premix ExTaq試劑盒說明行實時定量PCR反應。采用基于比較Ct法計算目的基因的相對表達水平。每次設定3個復孔,各重復3次。

1.5 Transwell檢測轉染后HTR8細胞的侵襲能力

將轉染后的各組細胞接種在涂有Matrigel膠的Transwell(8 μm)的頂室上。細胞于上室中使用不含FBS的RPMI-1640培養基培養,下室裝有含10%FBS的RPMI-1640培養基。培養24 h后,用70%乙醇固定侵入小室的細胞,并用0.1%結晶紫染色,并在光學顯微鏡下隨機選擇5個區域計數侵入細胞的數目。實驗重復3次。

1.6 Western blot檢測過表達與抑制miR-155后HTR8細胞中CXCR4蛋白的表達

通過使用SDS裂解溶提取各組細胞總蛋白,BCA測定試劑盒測量蛋白質濃度。通過10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離等量的蛋白質,然后轉移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。將膜用5%脫脂乳在室溫下封閉1 h,然后在4 ℃下與小鼠抗人CXCR4(1 ∶2 500)、小鼠抗人GAPDH(1 ∶1 500)單克隆抗體孵育過夜。將膜與HRP標記的二抗(1 ∶5 000)在室溫下孵育1 h。使用化學發光檢測系統(Thermo Fisher Scientific)檢測目的蛋白印跡條帶。目的蛋白的表達量以CXCR4/內參GAPDH比值表示。實驗重復3次。

1.7 統計學分析

符合正態分布的計量資料以平均值±標準差表示。所有統計分析均使用SPSS19.0軟件。使用Student’st檢驗或單因素ANOVA分析不同組間的差異。P<0.05表明差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA-SNHG5在重度PE胎盤中的表達

sPE組和正常組產婦在年齡[(26.55±3.21)歲vs(25.98±3.77)歲],體質量指數[(27.13±3.51)kg/m2vs(27.98±3.12)kg/m2]、孕周(35.13±4.32vs36.98±2.78)方面無統計學差異(P>0.05)。qRT-PCR檢測結果顯示,與正常組相比,sPE組lncRNA-SNHG5表達水平降低(0.88±0.22vs0.61±0.20,F=4.626,P<0.01,見圖1)。

與正常組比較,**P<0.01圖1 lncRNA-SNHG5在正常與重度PE胎盤中表達水平Figure 1 Comparison of lncRNA-SNHG5 expression between normal tissue and severe PE placenta

2.2 轉染后lncRNA-SNHG5 mRNA在各組HTR8細胞中的表達水平

qRT-PCR檢測結果顯示,與對照組相比,lncRNA-SNHG5 mRNA在過表達組HTR8細胞中表達水平顯著增高,在抑制組中表達水平顯著降低,以上差異有統計學意義(P<0.01,見圖2)。

2.3 lncRNA-SNHG5對miR-155/CXCR4表達的影響

qRT-PCR檢測結果顯示,與抑制組相比,過表達組HTR8細胞轉染pcDNA3.1-SNHG5后,miR-155表達水平降低(F=21.301,P<0.01,見圖3);與抑制組相比,過表達組HTR8細胞中CXCR4 mRNA水平(F=50.18,P<0.01)和蛋白表達水平(F=79.08,P<0.01)均升高(見圖3)。

與對照組比較,**P<0.01圖2 lncRNA-SNHG5在HTR8細胞中的表達水平Figure 2 Expression of lncRNA-SNHG5 in HTR8 cells of each group

2.4 lncRNA-SNHG5對HTR8細胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲試驗結果顯示,與對照組相比,過表達組細胞侵襲能力升高,抑制組細胞侵襲降低,差異有統計學意義(F=355.69,P<0.01,見圖4)。

3 討論

PE作為妊娠期特有疾病,發病率較高,嚴重威脅母嬰健康。其病因尚未完全明確,螺旋動脈重鑄不足,血管內皮細胞損傷、炎癥、遺傳等均與之相關;滋養細胞侵襲功能的下降可導致子宮螺旋動脈重塑障礙、胎盤淺著床已被認為是PE發病機制的重要過程[9]。目前,已有諸多研究明確了PE妊娠胎盤組織中差異表達的非編碼RNA(包括miRNAs、lncRNAs),這些非編碼RNA能夠介導滋養細胞功能發生變化,可能參與了PE發病過程[2,10]。本研究顯示,與正常晚孕胎盤組織相比,lncRNA-SNHG5在重度PE患者胎盤組織中呈病理性低表達(P<0.05)。lncRNA-SNHG5與直腸癌、黑色素瘤、乳腺癌等腫瘤密切相關,通過調控腫瘤細胞增殖、侵襲、凋亡等[11],參與疾病過程。但目前SNHG5與妊娠相關疾病的報道不多,且lncRNA參與疾病的相關具體機制仍需進一步探究。

與對照組比較,**P<0.01;與抑制組比較,##P<0.01圖3 HTR8細胞中miR-155、CXCR4 mRNA及蛋白的表達水平Figure 3 Expression of miR-155, CXCR4 mRNA and protein level in HTR8 cells in each group

與對照組比較,**P<0.01;與抑制組比較,##P<0.01圖4 lncRNA-SNHG5對HTR8細胞侵襲能力的影響Figure 4 Effect of lncRNA-SNHG5 on invasive ability of HTR8 cells in each group

基因組測序項目表明,人類基因組中有超過90%的基因組被轉錄為非編碼RNA,而lncRNA與miRNA作為最為重要的兩類非編碼RNA,除外能夠通過影響基因、表觀遺傳學等參與調節多種生理過程外,這兩者間還能夠通過競爭結合、“海綿效應”等方式[12,13],相互關聯,互相影響,共同構成了一個精細、復雜、值得探究的調控網絡。黑色素瘤細胞中lncRNA-SNHG5與miR-155之間的負向調控關系已得到驗證[5],SNHG5能夠通過對miR-155發揮ceRNA作用,間接影響相關細胞功能。本研究利用細胞平臺,在人滋養細胞HTR8中通過轉染實驗,對lncRNA-SNHG5進行過表達與抑制后,顯示miR-155表達出現了負性調控(P<0.05),這與Yan等[5]的研究結果一致。

miR-155可通過靶向調控CXCR4表達影響滋養細胞侵襲、遷移[8]。而本研究提示lncRNA-SNHG5與PE相關。在人滋養細胞系中,lncRNA-SNHG5可負向調控miR-155的表達。在此基礎上,本課題組進一步進行了Transwell侵襲試驗,證明過表達SNHG5后HTR8細胞侵襲能力升高(P<0.05);抑制其表達,則HTR8細胞侵襲力降低(P<0.05)。雖然研究結果顯示,lncRNA-SNHG5表達下降可導致滋養細胞侵襲力下降,這中間介導機制還不明確。故本課題對miR-155靶基因CXCR4表達進行深入分析,顯示SNHG5表達減弱后HTR8細胞中CXCR4在mRNA及蛋白水平均下降(P<0.05),這與張展等[14]的發現具有一致性。該結果提示lncRNA-SNHG5通過負向調控miR-155，進一步影響CXCR4表達，可能是其導致滋養細胞侵襲力下降的相關機制。

CXCR4作為基質細胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1,SDF1)的特異性受體,廣泛存在于母胎界面重要組織細胞中[15](胎盤滋養細胞、蛻膜自然殺傷細胞、血管內皮細胞中均有表達);CXCR4與miR-155在3′ UTR端具有互補結合的種子序列[7],有負性調控關系;CXCR4通過與SDF1的結合[16],在母胎界面中調控其下游相關通路,發揮交互作用,影響滋養細胞侵襲功能。PE時CXCR4/SDF1的失衡,進而影響滋養細胞侵襲力異常、胎盤淺著床的部分機制已得到驗證[17]。根據本研究結果顯示:PE相關lncRNA-SNHG5過表達可能對miR-155發揮了ceRNA樣作用,內源性競爭性結合并吸附miR-155,導致miR-155的表達被抑制;繼而間接降低了miR-155對CXCR4的負性調控,致使CXCR4表達增高,解除了miR-155對滋養細胞侵襲能力的抑制作用,使HTR8細胞侵襲力提高。反之,當lncRNA-SNHG5被抑制時,通過上述機制導致HTR8細胞侵襲力降低。后續lncRNA-SNHG5與miR-155在滋養細胞中競爭性結合的靶點,以及在HTR-8細胞中具體的結合部位、相關機制,還需進一步探討。

綜上,研究結果顯示子癇前期患者胎盤中lncRNA-SNHG5表達下降,可能通過影響miR-155/CXCR4途徑導致滋養細胞侵襲能力下降,可能是PE發病的潛在機制,這有待進一步探索。而新近研究表明[18],lncRNA已經具有了作為PE早期診斷與治療靶點的潛在可能;因此,本研究為后續探究PE病因機制,豐富PE的診治手段提供了新的思路和基礎。