過表達miR-140-5p的人臍帶間充質干細胞對骨關節炎的治療作用

彭 侃,魯 超,胡守業,井文森,王 波

(西安交通大學醫學部附屬紅會醫院關節病醫院骨壞死與關節重建病區,西安 710054;*通訊作者,E-mail:pengkan00@126.com)

骨關節炎(osteoarthritis, OA)是一種嚴重的關節退行性疾病,常導致患者關節疼痛和殘疾,其主要發病人群為老年人[1]。目前,骨關節炎的常用治療措施包括關節內注射非甾體類抗炎藥(NSAIDs)和細胞外基質(ECM)透明質酸成分,雖然上述療法可在一定程度上緩解關節痛,但其治療效果時效較短(1-4周)[2]。此外,關節置換手術僅適用于對治療無效的重癥骨關節炎患者,并且關節置換假體的壽命有限[3]。關節軟骨損傷是骨關節炎發病的主要特征之一,但是骨關節炎患者的關節軟骨自我修復能力較低。

大量研究證實間充質干細胞(MSC)具有自我更新能力并具有分化成多種譜系的潛力,現已被廣泛用于治療多種慢性疾病[4]。此外,MSC已經逐步應用于軟骨修復和骨關節炎治療中[5]。然而,現有研究表明MSC的分化能力并不強,只有少數注射的細胞可黏附于軟骨缺損部位[6,7]。據報道,與其他來源的MSC相比,人臍帶間充質干細胞(hUC-MSC)具有較低免疫原性,不會引起明顯的免疫排斥反應,所以hUC-MSC是同種異體移植的合適選擇[8]。因此,誘導hUC-MSC產生軟骨分化潛能可能有助于提高骨關節炎關節中的軟骨修復,然而,目前這方面的研究較少。

研究表明,一些microRNA(miRNA)在軟骨形成和骨關節炎發生中發揮重要作用,并且miRNA具有調節MSC生長分化的功能[9,10]。miR-140-5p是軟骨形成中的關鍵正調控因子,其可靶向調控MMP13、ADAMTS5、SOX9等基因來抑制炎癥和促進軟骨形成,其在預防和治療骨關節炎方面具有較高的潛力[11-13]。

因此,本研究通過慢病毒將miR-140-5p轉染至hUC-MSC,將其在骨關節炎大鼠模型中進行關節內注射,以探討高表達miR-140-5p的hUC-MSC在治療骨關節炎方面的潛在應用價值。

1 材料與方法

1.1 大鼠及主要試劑

60只SPF級8周齡雄性SD大鼠由西安交通大學醫學部實驗動物中心(SYXK(陜)2018-001)提供。DMEM/F12培養基、DMEM高糖培養基購自美國Gibco公司;成骨和成脂分化培養基購自賽業(蘇州)生物科技有限公司;FITC標記一抗(CD29、CD34、CD45、CD90、CD105和IgG)購自美國BioLegend公司;miR-140-5p模擬物或抑制劑、過表達miR-140-5p的重組慢病毒載體pLenO-DCE-Puro-miR-140-5p和空慢病毒載體委托上海吉瑪制藥技術有限公司合成;293T細胞購自北京索萊寶科技有限公司;茜素紅染色和油紅O染色試劑盒購自廣州賽業生物科技有限公司;Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司;Polybrene儲液、MTT測定試劑購自美國Sigma公司;Trizol試劑購自美國Invitrogen公司;PrimeScriptTMRT試劑盒、SYBR Premix Ex Taq購自日本TaKaRa公司;用于Western blot的一抗和二抗均購自美國Cell Signaling Technology公司;Pierce ECL化學發光液購自美國ThermoFisher公司;

1.2 hUC-MSC的分離和培養

無菌收集西安交通大學醫學部附屬紅會醫院正常足月剖宮產健康新生兒臍帶標本并在4 ℃保存。本研究已獲得本院倫理委員會批準，獲得患者監護人的知情同意后對標本進行收集。取5 cm左右的臍帶置于含有DMEM/F12培養基的培養瓶中,然后在無菌環境中取出臍帶,PBS沖洗并剔除血管,剝離出華通膠并剪碎成組織塊,將組織塊接種于含hUC-MSC培養基的培養瓶中,于37 ℃、5% CO2培養。每3 d更換培養基1次,每天觀察細胞的生長情況;待組織塊周圍長滿細胞時,更換培養基,當融合率達到80%-90%時,用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。

1.3 成骨和成脂分化及染色

根據說明書分別使用成骨和成脂分化培養基誘導分化進行評估。根據試劑盒說明,通過茜素紅染色考察hUC-MSC的成骨分化能力,通過油紅O染色試考察hUC-MSC的成脂分化能力,然后在Olympus顯微鏡下進行觀察(×100)。

1.4 流式細胞術鑒定人臍帶間充質干細胞

hUC-MSC的第3代通過流式細胞儀鑒定干細胞表面標記。將hUC-MSC用0.25%胰酶消化,PBS重懸,制備1×106/ml的細胞懸液。然后取100 μl的細胞懸液與20 μl的FITC標記的一抗(CD29、CD34、CD45、CD90、CD105和IgG)4 ℃避光孵育1 h,通過Beckman Coulter流式細胞儀檢測細胞的免疫熒光。

1.5 細胞增殖測定

用MTT法測定hUC-MSC的增殖能力。按照試劑盒說明,將1×104細胞在96孔板中培養48 h,用100 μl無菌MTT(0.5 mg/ml)在37 ℃染色4 h,除去培養基并加入150 μl二甲基亞砜,測量490 mm處的吸光度。

1.6 miR-140-5p過表達慢病毒轉染

用Lipofectamine 2000將pLenO-DCE-Puro-miR-140-5p和空慢病毒共同轉染293T細胞8 h,PBS洗滌3次,用含10%胎牛血清的高糖培養液培養72 h,每天觀察綠色熒光蛋白。收集轉染的293T細胞上清液并在4 000 r/min離心15 min,收集上清液并用0.45 μm微孔濾膜過濾,將濾液在25 000 r/min離心1 h,收集病毒沉淀并重懸于500 μl DMEM培養基中,4 ℃溶解過夜,將溶解后的病毒用EP管分裝并置于-80 ℃保存。含miR-140-5p的重組慢病毒懸液的滴度為2×108TU/ml,對照慢病毒的滴度為1×109TU/ml。將hUC-MSC分為3組:感染組(過表達miR-140-5p組)、空病毒組和對照組。將P3代hUC-MSC按1×105/孔接種于6孔板中過夜培養,感染組按照10 μl/孔加入重組慢病毒,空病毒組按照2 μl/孔加入空病毒,對照組未處理。另外,在每孔加入Polybrene儲液(終濃度為10 μg/μl),加入培養基培養24 h。之后用相同感染方式再次感染細胞,感染24 h時換液,72 h時收集細胞。

1.7 骨關節炎大鼠模型的建立及處理

將60只雄性SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、空病毒組和過表達miR-140-5p的重組慢病毒組(miR-140-5p組),每組15只。戊巴比妥鈉溶液(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,切斷大鼠右膝關節的前交叉韌帶建立骨關節炎模型[14]。模型組、空病毒組和miR-140-5p組大鼠進行建模,假手術組大鼠進行相同的手術操作,但不切斷前交叉韌帶。建模后第29天(4周后的第1天),空病毒組和miR-140-5p組大鼠在麻醉狀態下用30G針將50 μl空病毒或過表達miR-140-5p的重組慢病毒感染的hUC-MSC(1×106個細胞)注入關節腔內,假手術組和模型組注射等體積PBS。共給藥8周,每周注射3次。

1.8 番紅O-固綠染色和OARSI評分

給藥后第57天(給藥8周后的第1天),用4%多聚甲醛固定大鼠膝關節,石蠟包埋,切成5 μm厚的切片,脫蠟水合并按照生產商說明用番紅O-固綠染色染色以檢查膝關節軟骨的破壞情況。通過國際骨關節炎研究協會(OARSI)評分[15]評估各組大鼠的關節軟骨損傷程度。

1.9 RT-PCR檢測mRNA水平

給藥后第57天(給藥8周后的第1天),分離大鼠軟骨組織并在液氮中研磨,根據試劑盒說明書,用Trizol試劑提取大鼠軟骨組織的總RNA。用1 μg總RNA和PrimeScriptTMRT試劑盒通過反轉錄反應合成cDNA。用SYBR Premix Ex Taq在Applied Biosystems 7500實時PCR系統上進行RT-PCR。GAPDH和U6分別用作目的基因和miR-140-5p表達的內部對照。通過2-ΔΔCt方法分析RNA的相對表達。每個實驗至少重復3次。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.10 Western blot檢測SOX9、collagen Ⅱ、Aggrecan、NLRP3、caspase-1、MMP13和ADAMTS-5蛋白表達水平

在含1% Nonidet P-40、150 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris-HCl和0.1% SDS(含蛋白酶抑制劑)的緩沖液(pH 7.4)中裂解大鼠軟骨組織,將蛋白質溶液在4 ℃下以10 000 r/min離心10 min,以除去沉淀物。將變性的蛋白質溶液進行10% SDS-PAGE分離,電轉移到硝酸纖維素膜上。在室溫下用5% BSA封閉1 h,將膜與一抗在4 ℃孵育過夜。一抗如下所示:SOX9(1 ∶1 000)、collagen Ⅱ(1 ∶1 000)、Aggrecan(1 ∶1 000)、NLRP3(1 ∶1 000)、caspase-1(1 ∶1 000)、MMP13(1 ∶1 000)、ADAMTS-5(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶1 000)。二抗是HRP標記的山羊抗兔IgG(1 ∶1 000)。使用Pierce ECL化學發光液進行顯影。通過使用Image J軟件將條帶強度標準化為GAPDH。

1.11 統計學分析

使用SPSS 22.0軟件進行數據統計分析,符合正太分布的數據表示為平均值±標準差。通過t檢驗或單因素方差分析及LSD事后檢驗比較組間差異。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 hUC-MSC的鑒定結果

觀察分離培養的第3代(P3)hUC-MSC形態,結果見圖1。流式細胞儀檢測結果顯示,P3代hUC-MSC的表面標志物CD29表達率98.13%、CD90表達率98.92%、CD105表達率95.03%為高表達;造血干細胞表面標志物CD34表達率1.17%和CD45表達率0.96%為低表達(見圖2)。

圖1 倒置相差顯微鏡觀察第3代hUC-MSC形態 (×100)Figure 1 Morphology of the 3rd generation hUC-MSC under inverted phase contrast microscope (×100)

圖2 P3代hUC-MSC的表面標記物Figure 2 Surface markers of third generation hUC-MSC

分別在成骨和成脂誘導培養基中培養hUC-MSC細胞來考察成骨和成脂分化潛能,油紅O染色結果證實hUC-MSC可分化為脂肪細胞,茜素紅染色證實細胞可分化為骨細胞,hUC-MSC具備多向分化潛能(見圖3)。

圖3 茜素紅和油紅O染色檢測hUC-MSC的成骨和脂肪分化能力 (×100)Figure 3 Abilities of osteogenic and adipogenic differentiation of hUC-MSC by Alizarin red and oil red O staining (×100)

2.2 miR-140-5p對hUC-MSC增殖的影響

應用過表達miR-140-5p的重組慢病毒轉染的hUC-MSC(感染組)中miR-140-5p表達水平顯著高于對照組和空病毒組(P<0.05)。然而,感染組、空病毒組和對照組的細胞增殖能力差異無統計學意義(P>0.05,見圖4)。

與對照組和空病毒組比較,*P<0.05圖4 miR-140-5p在hUC-MSC中的表達及對hUC-MSC增殖的影響Figure 4 Expression of miR-140-5p in hUC-MSC and its effect on hUC-MSC proliferation

2.3 過表達miR-140-5p的hUC-MSC對骨關節炎大鼠軟骨退變的影響

假手術組大鼠膝關節軟骨和骨結構完整,而模型組的番紅O失染嚴重,關節軟骨發生明顯結構破壞;空病毒組也存在番紅O失染,但失染程度低于模型組;過表達miR-140-5p的hUC-MSC治療的大鼠(miR-140-5p組)的番紅O失染情況明顯好轉(見圖5)。模型組大鼠的OARSI評分顯著高于假手術組,而空病毒組和miR-140-5p組OARSI評分均顯著低于模型組,并且miR-140-5p組低于空病毒組(P<0.05,見圖5)。

2.4 過表達miR-140-5p的hUC-MSC對骨關節炎大鼠軟骨組織中軟骨分化標志基因表達的影響

基因表達結果顯示,模型組大鼠軟骨組織中的miR-140-5p表達水平明顯低于假手術組,miR-140-5p組miR-140-5p表達水平明顯高于其他組(P<0.05)。與假手術組相比,模型組的軟骨分化標志基因collagen Ⅱ(COL2A1)、Aggrecan和SOX9的表達水平均顯著降低,空病毒組和miR-140-5p組的collagen Ⅱ(COL2A1)、Aggrecan和SOX9的表達水平均顯著高于模型組,并且miR-140-5p組顯著高于空病毒組(P<0.05,見圖6)。

與假手術組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與空病毒組比較,&P<0.05B.各組大鼠膝關節的OARSI評分圖5 過表達miR-140-5p的hUC-MSC對骨關節炎大鼠軟骨退變的影響Figure 5 Effect of hUC-MSC overexpressing miR-140-5p on cartilage degeneration of rats

圖6 大鼠軟骨組織中miR-140-5p、collagen Ⅱ(COL2A1)、Aggrecan和SOX9的mRNA或蛋白表達Figure 6 The mRNA or protein expression of miR-140-5p, collagen Ⅱ(COL2A1), Aggrecan, and SOX9 in cartilage tissue of rats

2.5 過表達miR-140-5p的hUC-MSC對骨關節炎大鼠軟骨組織中炎癥因子表達的影響

與假手術組相比,模型組的軟骨組織中炎癥因子NLRP3、caspase-1、MMP13和ADAMTS-5的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05),空病毒組和miR-140-5p組的NLRP3、caspase-1、MMP13和ADAMTS-5的mRNA和蛋白表達水平均顯著低于模型組,并且miR-140-5p組的炎癥因子表達水平均顯著低于空病毒組(P<0.05,見圖7)。

圖7 大鼠軟骨組織中NLRP3、caspase-1、MMP13和ADAMTS-5的mRNA或蛋白表達Figure 7 The mRNA or protein expression of NLRP3, caspase-1, MMP13 and ADAMTS-5 in cartilage tissue of each group of rats

3 討論

關節軟骨損傷會降低其自我修復功能,提高關節軟骨的修復功能是治療骨關節炎的新策略。大量研究證實,干細胞具有分化潛能和抗炎功能,干細胞療法近年來已成為治療骨關節炎的新型治療方法[16]。間充質干細胞存在于人體的各種組織中,如骨髓、脂肪組織、臍帶組織、臍帶華通膠、韌帶等,并且間充質干細胞具有不同的增殖和分化潛能[17]。

目前治療骨關節炎的干細胞療法主要是脂肪來源的干細胞和骨髓間充質干細胞,關于臍帶間充質干細胞方面的研究較少。與其他來源的間充質干細胞相比,來源于臍帶華通膠的間充質干細胞在骨關節炎軟骨修復方面具有多種優勢。首先,新生兒臍帶標本豐富,因此可提供大量的hUC-MSC。其次,hUC-MSC的收集過程中不會對個體造成創傷或疼痛。再次,hUC-MSC增殖較快并且無致瘤性[18]。另外,hUC-MSC具有更高的可誘導性[19]。基于上述優勢,hUC-MSC在治療骨關節炎方面的應用前景廣闊。

多項研究已證明,micro RNA(例如miR-140、miR-146、miR-27b)在軟骨形成中起積極作用,并且其表達水平隨著骨關節炎的進展而逐漸減少[20]。有研究表明,關節內注射miRNA-140可通過調節細胞外基質(ECM)穩態來減弱大鼠骨關節炎的進展[21]。其他研究者提出,miR-140-5p是軟骨形成中的關鍵正調控因子,其可靶向調控MMP13、ADAMTS5、SOX9等基因來抑制炎癥和促進軟骨形成,其在預防和治療骨關節炎方面具有較高的潛力[11]。

本研究應用過表達miR-140-5p的重組慢病毒轉染hUC-MSC,研究表明轉染后hUC-MSC中的miR-140-5p表達水平顯著升高。先前的研究報道miR-140可以誘導軟骨細胞增殖[22],但在本研究中hUC-MSC的增殖能力未受到影響。其原因可能是由于miRNA具有協同干細胞增殖和分化平衡的作用,Liu等[23]證明miR-184控制著成年神經干細胞的增殖與分化之間的平衡。因此,miR-140-5p的過表達可能不會直接促進hUC-MSC的增殖,但可能促進了軟骨分化。

本研究中番紅O固綠染色和OARSI評分顯示,空病毒轉染的hUC-MSC和過表達miR-140-5p的慢病毒轉染的hUC-MSC均明顯抑制了骨關節炎大鼠的軟骨退變,并且過表達miR-140-5p的hUC-MSC的治療效果更好。胡瓊英等[24]應用人臍帶血間充質干細胞治療類風濕性關節炎小鼠,研究表明治療后小鼠臨床癥狀明顯改善,促炎因子表達水平顯著降低。曹娟等[25]應用臍帶間質干細胞干預后的骨關節炎新西蘭大白兔模型,研究顯示干預后兔滑膜增厚、關節積液等病變情況顯著改善,軟骨及滑膜炎性細胞浸潤減輕,IL-6、MMP-13等炎癥因子表達水平顯著降低。上述研究說明臍帶血間充質干細胞對關節炎疾病具有一定的治療作用,而通過上調hUC-MSC中miR-140-5p的表達后,其治療效果得到很大程度的提升。其原因與miR-140-5p的抗炎和促進軟骨形成的作用密切相關[11]。

關節軟骨是一種膠原纖維構成的軟骨,在關節活動中發揮緩沖壓力、承受力學負荷、潤滑、增加關節靈活性等重要作用。關節軟骨是一種專門的連接組織,其細胞外基質主要由蛋白多糖aggrecan和collagen Ⅱ等大分子組成[26]。SOX9基因是對骨骼系統發育有重要影響的轉錄激活因子,可在軟骨前體細胞和軟骨細胞中表達,并且SOX9可通過調控aggrecan和collagen Ⅱ來影響軟骨的生成[27]。collagen Ⅱ(COL2A1)、Aggrecan和SOX9均是軟骨分化標志基因,而collagen Ⅱ和Aggrecan是SOX9的下游信號分子。當上述基因表達降低時說明軟骨細胞外基質發生降解、軟骨組織受損。本研究顯示過表達miR-140-5p的hUC-MSC顯著上調了骨關節炎大鼠軟骨組織中collagen Ⅱ(COL2A1)、Aggrecan和SOX9的表達,說明該干細胞療法可明顯提高骨關節炎大鼠的軟骨修復功能。

NLRP3炎癥體信號通路參與介導骨關節炎的發病過程,其可調節促炎性細胞因子和降解酶的合成和釋放[28]。已有研究表明,兔膝骨性關節炎模型關節軟骨中NLRP3的表達水平顯著升高[29]。caspase-1是NLRP3的下游靶基因,不僅參與骨關節炎進展,而且可介導細胞凋亡和細胞焦亡。在MMPs組中,MMP-13是參與骨關節炎軟骨退變的主要酶,具有水解細胞外基質collagen Ⅱ蛋白的作用[30,31]。ADAMTS-5是與關節疾病相關的聚集蛋白聚糖酶[32]。下調ADAMTS-5的表達會減弱由炎癥介質刺激的軟骨細胞中aggrecan的降解,從而提供骨關節炎治療作用[33]。本研究結果表明,過表達miR-140-5p的hUC-MSC顯著抑制了骨關節炎大鼠軟骨組織中NLRP3、caspase-1、MMP13和ADAMTS-5的表達,說明該干細胞療法的軟骨治療功能與其對上述炎癥相關因子的抑制有關。

綜上所述,通過關節腔內注射過表達miR-140-5p的hUC-MSC可顯著抑制骨關節炎大鼠的軟骨退變并提高軟骨修復功能;過表達miR-140-5p的hUC-MSC可通過抑制NLRP3、caspase-1、MMP13和ADAMTS-5的表達來發揮軟骨治療作用。