短肋多指綜合征3型一家系的臨床表型和DYNC2H1基因突變分析

詹 瑛,張建芳,程 璐,徐 盈,陳必良

(1解放軍第63750部隊醫院婦產科,西安 710043;2空軍軍醫大學第一附屬醫院婦產科;*通訊作者,E-mail:zhzhhao@163.com)

骨骼發育不良是一類異質性很大的遺傳性疾病,主要與軟骨和骨骼發育過程異常有關。國外的一項研究報道指出目前有226個基因與456種已知的遺傳性骨骼發育不良相關[1]。短肋多指綜合征(short-rib polydactyly syndromes, SRPSs)就是其中的一組骨骼發育不良癥候群,是由纖毛功能紊亂導致的以肋骨短小、長骨短小、多指(趾)畸形,伴多臟器損害為特征的一種罕見的常染色體隱性單基因遺傳病。根據國際骨軟骨發育不良分類,已識別出4種不同類型的SRPS[2]。其中短肋多指綜合征3型(short-rib polydactyly syndrome type Ⅲ,SRPS Ⅲ)是其中表型最重、預后較差的一種,往往妊娠中期以后宮內即有影像學的異常表現。盡管影像學技術現今取得了巨大的進步,但胎兒骨骼發育不良數量眾多且表型特征往往多有重疊,故而仍然難以實現精準的產前診斷。鑒于該類疾病各種形式的廣泛的遺傳型和表現型異質性,基于傳統Sanger測序確定可能的致病基因是不切實際、費時費力的。因此,基于二代測序(NGS)技術的靶向捕獲、全外顯子測序、全基因組測序等為識別遺傳性骨骼疾病的致病突變提供了一種新的高效的方法。

本研究基于NGS采用全外顯子測序(whole exome sequencing,WES)的方法對一個SRPS Ⅲ家系引產胎兒進行全外顯子測序,數據分析結果顯示該先證者的DYNC2H1基因存在復合雜合突變c.2346-1G>A和c.7292+4T>C,再結合PCR和Sanger測序在該家系中進行驗證,先證者兩處變異分別遺傳自其父母,符合SRPS Ⅲ常染色體隱性遺傳的規律。從遺傳學的角度初步明確了該家系中先證者SRPS Ⅲ的可能發病原因,為其臨床診斷提供了有力的證據,為該家系的遺傳咨詢和產前診斷提供了可靠的分子依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

該家系中母親孕2產0,2016年及2017年均因“胎兒四肢極度短小”于孕中期引產。夫妻雙方非近親結婚,否認雙方家族中遺傳病史。2016年6月第1次妊娠,孕早期經過順利,孕13周時西安市第四醫院產科超聲提示胎兒雙肺回聲增強、胎兒四肢形態異常,未見明確長骨回聲,腹腔囊性包塊,鼻骨顯示不清;連續4周超聲動態監測胎兒骨骼系統發育情況仍提示胎兒四肢形態異常,成骨發育不全可能。該家系決定終止妊娠,由于當時就診醫院客觀條件受限,引產胎兒未做尸檢,未留取樣本進一步行基因檢測。2017年4月該家系中母親第2次妊娠,孕12周西安市第四醫院產科超聲檢查提示胎兒全身皮膚水腫,頭頸部淋巴水囊瘤,建議加強產檢、進一步行產前診斷。孕17周時復查超聲提示胎兒頸部水囊瘤,雙腎盂重度積水,胎兒四肢長骨短小、雙手可見多指,胎兒心臟異常,建議進一步胎兒心動超聲及產前診斷。該孕婦及家屬堅決要求終止妊娠,且為求進一步遺傳咨詢轉往西京醫院。于孕17+4周時引產,引產胎兒為男性體征,查體可見全身皮膚輕度水腫,四肢明顯短小,雙手六指畸形,余外觀未見明顯異常。留取引產胎兒臍帶組織行基因檢測。

1.2 基因組DNA提取

該家系夫妻雙方知情同意,簽署知情同意書后,采用EDTA抗凝管抽取該夫妻雙方靜脈血各5 ml,按血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生物科技有限公司)提取外周血基因組DNA,-20 ℃保存備用。

1.3 全外顯子測序

將該家系中二胎患病胎兒的新鮮臍帶組織5 g左右,剔除結締組織,吸水紙吸干血液,剪碎后放入研缽,倒入液氮磨成粉末,按DNA提取試劑盒(北京天根生物科技有限公司)說明書提取胎兒DNA,送至北京金準醫學檢驗所,利用Agilent SurSelect人全外顯子組芯片捕獲試劑盒構建文庫,使用Illumina Hiseq X Ten測序平臺進行二代測序,數據經過質量控制后與基因組參考序列進行比對,查閱相關數據庫綜合分析判斷可疑變異的致病性。

1.4 PCR和Sanger測序驗證

根據全外顯子高通量測序的結果,用PCR結合Sanger測序對二胎胎兒及其父母進行突變檢測和驗證。針對DYNC2H1基因的c.2346-1G>A和c.7292+4T>C位點采用Primer5.0軟件設計跨越16號、44號外顯子上下游的引物序列。DYNC2H1-16F:TGGCTTAGCAACTGTAGAAGCA,16R:AGCCCGGATTTCTTCAAAAG;DYNC2H1-44F:TTGACGTATCAAGGATTTTATG,44R:CTGTTCATACACTTGTACCAT。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應條件為:95 ℃ 10 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,共35個循環,最后72 ℃延伸5 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,之后進行雙向測序。

2 結果

2.1 全外顯子高通量測序結果

引產胎兒基因組DNA高通量測序數據分析發現胎兒DYNC2H1基因存在c.2346-1G>A變異和c.7292+4T>C變異兩處雜合突變(見圖1),兩處變異在人群dbSNP數據庫、HGMD數據庫、ClinVar數據庫中均未見報道。查閱HGMD與ClinVar數據庫,DYNC2H1基因據報道與短肋多指綜合征相關。短肋多指綜合征為常染色體隱性遺傳病,上述兩處變異均為DYNC2H1基因內含子區域的變異,其中c.2346-1G>A位點變異位于16號內含子-1位,緊鄰17號外顯子,處于“經典剪接區域”,該區域的堿基突變一般均會對原剪切位點產生影響;c.7292+4T>C位點變異位于44號內含子+4位,緊鄰44號外顯子,緊挨“經典剪接區域”，該區域的堿基突變一般均會對原剪切位點產生影響。DYNC2H1基因上述兩個位點的變異高度懷疑會影響轉錄水平內含子序列的剪切,進而影響DYNC2H1基因所編碼的蛋白質功能。利用Human Splicing Finder軟件(http://www.umd.be/HSF/)對上述兩個內含子區域位點進行生物信息學的在線預測,結果提示,c.2346-1G>A位點對于剪切影響的可能超過70%,c.7292+4T>C位點可能不影響原有的剪接方式(見圖2)。

圖2 HSF生物信息學軟件預測DYNC2H1基因變異位點的影響Figure 2 The predicted influence of DYNC2H1 gene mutations through HSF software

圖1 胎兒DYNC2H1基因變異位點在基因序列中的位置Figure 1 The locations of the fetal mutations on DYNC2H1 gene sequencing

2.2 Sanger測序驗證結果

Sanger測序結果顯示,患病胎兒DYNC2H1基因c.2346-1G>A、c.7292+4T>C的復合雜合突變分別來自該家系中的母親及父親,其父母分別為上述雜合突變的攜帶者,該遺傳方式符合常染色體隱性遺傳(見圖3),如果上述兩處變異為致病性突變,該家系再次妊娠有1/4的概率生育患者。

圖3 該家系中DYNC2H1基因變異Sanger測序驗證結果Figure 3 The validation of the mutations of DYNC2H1 gene in the affected family

3 討論

遺傳性骨病是指由于遺傳物質改變導致骨骼畸形的一類遺傳性疾病,它是一大類具有遺傳異質性和表型異質性的骨軟骨發育不良病。這類疾病大多是發病率很低的罕見病,但種類繁多,總發病率大于1/5 000[3]。這些骨病發病早,癥狀明顯,以骨骼塑形、生長、分化、內穩態異常為主要特征,通常造成患者致殘甚至致死,其發病率與死亡率相當可觀,而且此類骨病還會逐代或隔代遺傳,故危害十分嚴重,往往給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔。短肋多指綜合征(SRPSs)是其中的一種常染色體隱性遺傳性骨病。雖然SRPSs影像學表現往往以肋骨短小、長骨短小、多指(趾)畸形、伴多臟器損害為特征,但其病情輕重程度、病因及預后往往多種多樣,而且常在胎兒發育期間宮內即有表現,產前診斷SRPSs難度很大,許多時候孕婦在尚未查明病因時便選擇了終止妊娠,無法為再次妊娠提供產前診斷的可靠依據。根據國際骨軟骨發育不良分類,四種不同類型的SRPSs已被確認,分別為SRPS Ⅰ型(Saldino-Noonan綜合征)、SRPS Ⅱ型(Majewski綜合征)、SRPS Ⅲ型(Verma-Naumoff綜合征)、SRPS Ⅳ型(Beemer-Langer綜合征),其中SRPS Ⅰ型和SRPS Ⅲ型目前已被認為是同一類型,也是表現最為嚴重的一種類型[2,4]。目前與SRPS Ⅲ型相關的致病基因均屬于鞭毛細胞內運輸(IFT)相關基因,如DYNC2H1、IFT80、WDR34、WDR35、WDR60等[5-8]。

本研究中孕婦連續兩胎均出現相同的臨床表型,遺傳性骨骼疾病和單基因病的可能性非常大[9]。本課題組用家系全外顯子組測序檢測發現胎兒DYNC2H1基因存在復合雜合突變(c.2346-1G>A變異和c.7292+4T>C變異)。DYNC2H1基因Sanger測序驗證結果顯示,胎兒c.2346-1G>A和c.7292+4T>C分別來自健康的母親和父親,符合常染色體隱性遺傳方式。DYNC2H1基因位于染色體11q22.3,長13 kb,有90個外顯子。目前我國僅有數例散發SRPS Ⅲ型病例報道是由DYNC2H1基因突變所致[10-13],而且具有明顯的遺傳異質性和表型多樣性。DYNC2H1基因編碼胞質動力蛋白亞基重鏈,是纖毛內轉運蛋白復合體A的組成部分,在逆向轉運過程中,纖毛內轉運蛋白復合體A與胞內信號分子結合,胞質動力蛋白亞基與纖毛頂部的雙微管結合,并沿著雙微管從纖毛頂部向底部移動,并參與纖毛蛋白的循環利用。表明DYNC2H1蛋白在哺乳動物纖毛的延伸組成和形態維持方面都具有關鍵的作用,而纖毛是軟骨內骨發育過程中的重要組成部分[14]。纖毛結構廣泛分布于真核動物的各類細胞中,其結構進化高度保守,所以DYNC2H1基因的致病性變異表現為以軟骨、骨骼成骨異常為主要表型特征,伴隨多系統畸形的一組異型性疾病。Schmidts等[15]檢測到DYNC2H1基因敲除影響秀麗隱桿線蟲和小鼠的纖毛內轉運蛋白復合體逆向轉運功能,導致纖毛發育異常,并觀察到與骨骼發育緊密相關的Hedgehog信號通路出現異常調控,導致骨骼發育缺陷。SRPS Ⅲ型是一種典型的骨骼纖毛疾病,初級纖毛和胞質動力蛋白是骨骼發育過程中形態發生途徑的必要組成部分,細胞纖毛運輸蛋白在軟骨細胞的成熟方面具有非常重要的作用[16]。

截止2020年4月,ClinVar數據庫已報道DYNC2H1基因致病或可能致病的變異位點有236個(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/),而本研究發現的兩處可疑致病位點尚無文獻報道。研究表明DYNC2H1基因龐大尚沒有熱點突變,這些突變基本都是復合雜合突變,但到目前為止并沒有發現純合突變,沒有純合子的形成可能是因為該基因過于保守和關鍵,純合子的早期胚胎已死亡[12]。本研究中發現的c.2346-1G>A變異和c.7292+4T>C變異均位于DYNC2H1基因內含子區域,生物信息學軟件借助特定算法預測其一高度可能影響剪切受體,其一可能不影響原有剪切,但是否真正影響剪切只有通過分子生物學實驗進一步驗證才能確定。綜上所述,對于該家系課題組利用WES技術在該家系中篩選出了兩個高度可疑的DYNC2H1基因致病位點,且在家系中存在遺傳共分離現象,結合臨床表型分析,上述兩個位點很可能是該家系的致病位點,建議家系再次妊娠之前完成其致病性的驗證,可以定制Minigene驗證上述兩個位點對DYNC2H1基因轉錄水平的影響,進而分析其致病性。若為致病性變異,則可以根據上述兩個位點進行產前診斷或是胚胎植入前遺傳學診斷,從而實現SRPS Ⅲ型患者在家族中的阻斷,指導家系成員實現優生優育。

近些年來二代測序技術已經廣泛應用于臨床疾病的基因突變檢測,研究者可以根據基因突變的特點與其他傳統的檢測技術結合使用,相互配合取長補短,幫助臨床上更加經濟、精準、快速地診斷疾病。遺傳性骨病的致病基因種類繁多,每個基因的致病位點動輒上百,如果用Sanger測序逐一排查經濟效率極其低下,所以本研究選擇NGS和Sanger測序相結合的方法進行基因診斷,可以快速準確找到致病基因及致病位點,大大提高檢測效率。