白豆蔻總黃酮的提取及抗氧化活性研究

李利華，郭豫梅

(陜西理工大學 化學與環境科學學院，陜西 漢中 723000)

白豆蔻，為芭蕉目姜科豆蔻屬植物白豆蔻的果實，可藥食兼用。中醫認為，白豆蔻性溫、味辛，歸肺、脾胃經，有溫中止嘔、化濕行氣的功效，常用來治療濕阻所滯、脾胃不和、脘腹脹滿、不思飲食等[1,2]。現代研究表明，白豆蔻中含有揮發油、精油、萜烯類化合物等物質，具有抑菌、平喘、芳香健胃、驅風等多種藥理作用[3,4]。

黃酮類化合物是指以C6—C3—C6為基本碳架的一系列化合物，其基本母核為2-苯基色原酮[5]。黃酮類化合物廣泛存在于自然界植物體中，因其有較多的藥用功效[6,7]，已成為天然藥物的研究熱點之一。目前對白豆蔻的研究主要集中在白豆蔻揮發油[8,9]，對于白豆蔻黃酮類化合物的研究較少，僅有朱云霞等利用高速逆流色譜從白豆蔻中分離出5-羥基-3，7，4′-三甲氧基黃酮[10]，而對于白豆蔻總黃酮的提取尚未見報道。本實驗以乙醇為溶劑提取白豆蔻中的總黃酮類化合物，通過單因素實驗和正交實驗設計優化總黃酮的提取工藝條件，并通過對羥基自由基(·OH)的清除及超氧陰離子自由基(O2-·)的清除，考察白豆蔻總黃酮的抗氧化活性，為白豆蔻總黃酮的進一步開發利用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

白豆蔻：購于當地藥材市場；將白豆蔻洗凈，低溫烘干，粉碎備用。

蘆丁標準品：優級純；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、水楊酸、硫酸亞鐵、雙氧水、鄰苯三酚等：以上試劑均為國產分析純。

UV型紫外-可見分光光度計 日本島津儀器公司；TDL-9001型光電分析天平 北京梅特勒精密儀器公司；PHS-3C 酸度計 北京賽多利斯儀器有限公司；SHB-III循環水式真空泵 開封宏興科教儀器廠。

1.2 實驗方案

1.2.1 標準曲線的繪制

以蘆丁為標準品，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法[11]。配制一系列不同濃度梯度的蘆丁標準溶液，分別顯色后于510 nm處測定吸光度值，得到標準曲線方程：A=5.342C-0.208，R=0.9979，其中C為蘆丁濃度(mg/mL)，A為對應的吸光度值。

1.2.2 白豆蔻總黃酮的提取及總黃酮含量的測定

準確稱取白豆蔻粉末3.00 g，按照一定的料液比(g/mL)加入提取劑乙醇，設定一定的提取溫度和提取時間浸提白豆蔻總黃酮，抽濾，即得白豆蔻總黃酮提取液。

精密吸取定容好的溶液提取2.00 mL于25 mL容量瓶中，按照1.2.1的方法顯色后，在510 nm處測定溶液的吸光度，計算白豆蔻總黃酮提取率。

白豆蔻總黃酮提取率(%)=(測得總黃酮濃度×溶液體積×稀釋倍數)/干樣品質量。

1.2.3 單因素實驗

以提取率為衡量指標，分別考察乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%)、料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)、提取溫度(40，50，60，70，80 ℃)、提取時間(20，40，60，80，100 min)對白豆蔻總黃酮提取率的影響效果，篩選出各因素的最優水平區間，每個處理做3份平行。

1.2.4 正交實驗設計

根據各單因素實驗的優選結果，設計四因素三水平的正交實驗，利用L9(34)正交實驗表優化白豆蔻總黃酮提取工藝，正交實驗因素水平見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 白豆寇總黃酮抗氧化性能實驗

參照文獻[12,13]的方法并略有改動。以Vc為陽性對照品，考察白豆蔻總黃酮對羥自由基(·OH)和超氧陰離子自由基(O2-·)的清除能力。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 乙醇濃度對白豆蔻總黃酮提取率的影響結果

圖1 乙醇濃度對提取率的影響Fig.1 The effect of ethanol concentration on the extraction rate

由圖1可知，乙醇濃度在40%～60%內，白豆蔻總黃酮提取率隨乙醇濃度的增加呈上升趨勢，當乙醇濃度為60%時提取率最高，為2.41%，而當乙醇濃度高于60%后，白豆蔻總黃酮提取率逐漸下降，這可能是因為乙醇濃度越高，醇溶性雜質、色素及親脂性強的組分浸出量會增加，導致黃酮類化合物提取率下降。因此，乙醇濃度選擇60%左右最佳。

2.1.2 料液比對白豆蔻總黃酮提取率的影響結果

圖2 料液比對提取率的影響Fig.2 The effect of ratio of solid to liquid on the extraction rate

由圖2可知，料液比在1∶20～1∶40內，隨著料液比的增大，白豆蔻總黃酮提取率明顯上升，當料液比為1∶40時提取率最高，為2.26%，而當料液比大于1∶40后，白豆蔻總黃酮提取率有所下降。這可能是因為適當增大提取劑用量有利于白豆蔻總黃酮的溶出，但提取劑用量過大，一方面總黃酮的溶出已達飽和，另一方面其他雜質成分的溶出會增多，增加了后續濃縮、分離純化的負擔。因此，料液比選擇1∶40左右最佳。

2.1.3 提取溫度對白豆蔻總黃酮提取率的影響結果

圖3 提取溫度對提取率的影響Fig.3 The effect of extraction temperature on the extraction rate

由圖3可知，提取溫度在40～80 ℃范圍內，隨著溫度的升高白豆蔻總黃酮提取率呈先上升后下降的趨勢，70 ℃時總黃酮提取率達最大值，為2.38%，當提取溫度高于70 ℃時，白豆蔻總黃酮提取率有所下降；這可能是因為過高的溫度會引起黃酮分子發生裂解，使得提取率降低。因此，提取溫度選擇70 ℃左右最佳。

2.1.4 提取時間對白豆蔻總黃酮提取率的影響結果

由圖4可知，提取時間在20～60 min范圍內，白豆蔻總黃酮提取率隨提取時間的延長逐漸增加，且在提取時間60 min時提取率最高，為2.32%，而當提取時間超過60 min后，白豆蔻總黃酮提取率有所下降。可能的原因是長時間受熱會使已溶出的黃酮類化合物鍵斷裂，導致總黃酮提取率降低。因此，提取時間選擇60 min左右最佳。

圖4 提取時間對提取率的影響Fig.4 The effect of extraction time on the extraction rate

2.2 正交實驗設計結果

表2 正交實驗結果Table 2 The results of orthogonal experiment

由表2可知，比較K值大小可得到白豆蔻總黃酮的最優提取條件為A2B1C2D2，即：乙醇濃度60%，料液比1∶30 (g/mL)，提取溫度70 ℃，提取時間60 min；由極差R值可得出4個因素對總黃酮提取的影響主次順序為A(乙醇濃度)>C(提取溫度)>D(提取時間)>B(料液比)。

2.3 驗證性實驗

表3 驗證實驗結果Table 3 The results of verification experiment

由表3可知，在優化得到的最佳工藝條件下，白豆蔻總黃酮平均提取率為2.82%，高于表2正交實驗設計表中的9組提取率結果，RSD<1.65%，表明該工藝條件穩定，可以作為白豆蔻總黃酮的提取工藝條件。

2.4 白豆蔻總黃酮抗氧化活性實驗結果

2.4.1 對·OH清除實驗結果

圖5 白豆蔻總黃酮對·OH的清除作用Fig.5 The scavenging effect of total flavonoids from Amomum kravanh against·OH

由圖5可知，隨著白豆蔻總黃酮提取液濃度的增大，其對·OH的清除率逐漸升高，在實驗濃度范圍內最大清除率為73.7%；與對照品Vc比較可知，Vc對·OH的最大清除率為90.1%，高于白豆蔻總黃酮，說明白豆蔻總黃酮對·OH具有一定的清除能力，但清除能力低于Vc對照品。

2.4.2 對O2-·清除實驗結果

圖6 白豆蔻總黃酮對O2-·的清除作用Fig.6 The scavenging effect of total flavonoids from Amomum kravanh against O2-·

由圖6可知，隨著白豆蔻總黃酮提取液濃度的增大，其對O2-·的清除率逐漸升高，在實驗濃度范圍內白豆蔻總黃酮對O2-·的最大清除率為87.8%，對照品Vc的最大清除率為90.3%；由此可知，在實驗濃度范圍內，白豆蔻總黃酮對O2-·的清除能力與Vc相當。

3 結論

本實驗以乙醇為溶劑提取白豆蔻中的總黃酮，通過單因素實驗和正交實驗優化提取工藝；以羥基自由基清除率及超氧陰離子自由基清除率為指標，考察白豆蔻總黃酮的抗氧化性。實驗結果表明，白豆蔻總黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度60%，料液比1∶30 (g/mL)，提取溫度70 ℃，提取時間60 min，在此工藝條件下，白豆蔻總黃酮提取率為2.82%，說明該優化工藝條件穩定，可以作為白豆蔻總黃酮的提取工藝條件。白豆蔻對羥基自由基(·OH)和超氧陰離子自由基(O2-·)的清除實驗顯示，在實驗范圍內對·OH的最大清除率為73.7%，對O2-·的最大清除率為90.1%，與Vc對照品比較可知，在實驗范圍內白豆蔻總黃酮對·OH的清除能力略低于Vc，對O2-·的清除能力與Vc相當，說明白豆蔻總黃酮對·OH和O2-·均具有一定的清除能力。本研究結果可為白豆蔻總黃酮類化合物的工業化生產和進一步開發利用提供一定的理論參考。