苜蓿冰結構蛋白對冷凍濕面筋品質及結構的影響

曲 敏，吳 征，杜婷婷，朱秀清，陳鳳蓮，李凌俐，盧曼曼

（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076）

冰結構蛋白（ice structuring proteins，ISPs），又稱抗凍蛋白或熱滯蛋白，是我國于2006年批準可用于冷凍食品的新型添加劑。ISPs可由多種生物如魚類，植物及昆蟲體內所合成以保證其在低溫生存[1-2]。它能以非依數形式降低水溶液冰點，具有熱滯活性（thermal hysteresis activity，THA），可與冰表面不可逆結合，通過修飾冰晶形態來抑制冰晶產生和生長，使已有冰晶體顆粒大小之間重新分配，抑制冰晶重結晶[3-5]。Liu Mei等[6]發現重組胡蘿卜抗凍蛋白可有效減少凍藏產生的冰晶數量，顯著提高了冷凍面團所制面包的質量；潘振興等[7]發現冰結構蛋白對長期凍藏冷凍面團發酵特性與超微結構的抗凍保護作用。而冷凍面團品質下降的主要原因是，面筋蛋白在冷凍過程中品質發生劣變[8]。因此，研究ISPs在冷凍過程中對面筋蛋白的品質影響，可為改善冷凍面團品質提供依據。

紫花苜蓿俗稱金花菜，是重要的豆科牧草，亦可食用。其鮮品中蛋白含量高達18%以上。苜蓿耐寒能力極強，在-45 ℃極寒條件下返青率仍達90%。本課題組在前期研究中，以紫花苜蓿干草為原料，采用冰結合磷酸鹽緩沖溶液法提取苜蓿冰結構蛋白（alfalfa ice-structuring proteins，AISPs），混合蛋白電泳結果顯示，AISPs由兩2 個組分組成，其分子質量分別約為34 kDa和52 kDa，經差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀檢測THA為0.54 ℃，且其冰晶體積小、數量多，多呈菱形，具有很好的抗凍活性[9]。將AISPs添加到冷凍面團中，冷凍面團的硬度明顯降低，彈性、回復性和內聚性稍增大，咀嚼性有所下降，改善了冷凍面團的品質[10]。將AISPs添加到速凍餃子皮中，速凍餃子皮的持水性顯著提高，無明顯開裂或無開裂。掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）結果顯示，AISPs有效地改善了濕面筋蛋白的網絡結構，并對生、熟餃子皮的質構特性產生了影響，可有效地保護餃子皮質地的均一性及穩定性[9]。本研究以苜蓿干草為原料提取AISPs，對其氨基酸組成及分離純化后不同組分的THA、糖蛋白和二級結構進行鑒定，并將其與冷凍濕面筋粉混合，檢測濕面筋蛋白持水性、可凍結水含量、蛋白分子質量及微觀結構的變化。探究AISPs對冷凍濕面筋的品質和結構的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北大荒高筋面包粉 黑龍江北大荒有限公司；“肇東”紫花苜蓿 黑龍江省農業科學院草業研究所蘭西苜蓿種植基地；考馬斯亮藍G250 上海科技發展有限公司；乙醇、叔丁醇、戊二醛、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、丙烯酰胺、過硫酸銨、甘氨酸、雙丙烯酰胺（均為分析純） 天津市致遠化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；ZLG-10型真空冷凍干燥機 北京博醫康試驗儀器有限公司；R-205旋轉蒸發儀 上海中勝生物技術公司；Z366高速大容量離心機 上海浦東物理光學儀器廠；EMS-9A磁力攪拌器 天津歐諾儀器儀表有限公司；SE-3400N SEM 日本日立公司；Q200 DSC儀 美國TA公司；TDL80-2B臺式小離心機 上海安亭科技儀器廠；Nexus-470傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）儀 美國Nicolet公司。

1.3 方法

1.3.1 AISPs的提取

參考文獻[11]中改進的冰球結合磷酸緩沖溶液法提取AISPs。將得到的冰提AISPs溶液冷凍干燥，即得AISPs凍干粉，備用。

1.3.2 AISPs的氨基酸組成分析

參照賈青慧等[12]的方法進行測定。

1.3.3 AISPs分離純化

參照張延紅等[13]的方法進行改進分離純化AISPs。經檢測AISPs的等電點為3.4，故采用陰離子交換色譜柱DEAE-52進行分離純化。分離條件為：離子交換洗脫液pH 8.0、緩沖液濃度20 mmol/L、上樣量1 mL，上樣質量濃度40 mg/mL。收集各洗脫峰，于40 ℃旋轉蒸發，待液體濃縮至10 mL左右停止旋蒸，裝入透析袋，2～3 h更換一次透析液，透析48 h后經冷凍干燥，配成質量分數10%的溶液進行后續鑒定。

1.3.4 AISPs分離組分的THA檢測

參照曲敏等[9]方法進行測定。THA與冰核含量計算方法如下：

式中：Th為保留溫度；T0為在不同停留溫度下體系的開始結晶溫度。

式中：Φ為冰晶質量分數/%；ΔHf、ΔHm分別為AISPs溶液的結冰焓和熔融焓。

1.3.5 AISPs分離組分糖蛋白的鑒定

參照劉翠芳等[14]的方法并改進。將含有樣品的濾紙浸在70%乙醇溶液中，片刻后吹干，在高碘酸溶液中浸5 min，用70%乙醇溶液清洗后于還原液中浸5～8 min，用70%乙醇溶液清洗，在亞硫酸-品紅溶液中浸24～25 min后用亞硫酸鹽沖洗3 次，乙醇脫水后，吹干。

1.3.6 AISPs分離組分的FTIR檢測

參照張秋會等[15]的方法并改進。準確稱取1 mg待測樣品，加入100 mg溴化鉀，研磨均勻后進行壓片，進行FTIR的測定。測定波數在4 000～400 cm-1之間的吸收光譜，波數精度為0.01 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數為32 次。

1.3.7 面筋蛋白干粉的制備

參照姜小苓等[16]的方法并改進。稱取150 g脫脂小麥面粉，加入100 mL蒸餾水（不超過20 ℃）揉成面團后，置于含500 mL蒸餾水的1 L大燒杯中，靜置30 min。經過一系列蒸餾水揉洗（2×300 mL，2×150 mL，4×100 mL，4×75 mL和6×50 mL），得面筋蛋白組分，將其冷凍干燥后，粉碎、過80 目篩，即為面筋蛋白干粉。

1.3.8 濕面筋樣品的凍藏與凍融處理

將面筋蛋白干粉分別與添加量0%、0.5%、1%、1.5%的AISPs凍干粉充分混勻，溶于蒸餾水中。一組于-18 ℃及-40 ℃凍藏1、3、5、7 周；另一組于-18 ℃及-40 ℃凍融1、3、5、7 周（每周解凍1 次）。測定前在室溫下進行解凍。

1.3.9 濕面筋蛋白持水性的測定

參照李翠翠等[17]的方法并改進。取解凍后的樣品以10 000 r/min離心15 min，倒掉離心出來的液體，以離心前后樣品的質量差與樣品質量的比值，評估樣品的持水性。

1.3.10 濕面筋蛋白可凍結水含量的測定

參照錢曉潔等[18]的方法并改進。取面筋蛋白樣品10 mg放在鋁制坩堝中進行壓片。將坩堝放入DSC中，在-15 ℃和5 ℃保持5 min，然后從-15 ℃升溫到5 ℃，升溫速率為1 ℃/min。

1.3.11 濕面筋蛋白的SDS-PAGE測定

參照張延紅等[13]的方法并改進。采用12%分離膠、4%濃縮膠，電泳初始電壓100 V，待條帶跑至濃縮膠與分離膠界面時改為80 V。電泳結束后，染色、脫色處理，拍照。用Quantity One軟件對電泳圖進行分子質量分析與確定。

1.3.12 冷凍濕面筋蛋白微觀結構觀察

參照郭金英等[19]的方法并改進。將干燥樣品固定在樣品臺上，用鍍膜儀鍍上金屬膜，置于SEM下觀察樣品的結構。

1.4 數據統計方法

所有數據平行測定3 次，采用SPSS 17.0軟件進行方差分析，結果以±s表示；用Microsoft Excel 2010軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 AISPs的氨基酸組分分析

由表1可以看出，AISPs含17 種氨基酸。含量最多的為天冬氨酸占1.75%，其次是谷氨酸占1.64%，兩者皆為親水性氨基酸。含量最低的是蛋氨酸占0.07%。親水性與疏水性氨基酸的比例約為7∶4，說明AISPs具有較強的親水性，可與冰晶表面水分結合，從而修飾冰晶形態、抑制冰晶生長。

2.2 AISPs組分的鑒定

2.2.1 AISPs組分的分離

從圖1A可以看出，共有4 條洗脫峰。對分離出的AISPs蛋白組分進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測，結果如圖1B所示，可以看出條帶清晰的P2、P4組分分別約為34、52 kDa，故取其進行后續檢測。

表1 氨基酸組成及含量Table 1 Amino acid composition of AISPs

圖1 AISPs組分的層析譜圖（A）及SDS-PAGE檢測結果（B）Fig.1 Chromatographic separation (A) and SDS-PAGE (B) of AISPs

2.2.2 THA的DSC檢測結果

表2 AISPs P2組分的THA檢測結果Table 2 THA measurement of component P2 of AISPs

表3 AISPs P4組分的THA檢測結果Table 3 THA measurement of component P4 of AISPs

圖2 AISPs組分的DSC熱流曲線Fig.2 DSC heat flow curve of AISPs components

由表2、3和圖2可看出，隨著停留溫度升高，放熱曲線面積變大，處于該停留溫度下的冰核質量分數減少。P2組分隨著停留溫度升高，THA逐漸降低，當停留溫度從-0.75 ℃升高至-0.29 ℃時，冰核質量分數從73.86%降至33.63%；P4組分，隨著停留溫度升高，THA先穩定后降低，當停留溫度從-0.75 ℃升高至-0.28 ℃時，冰核質量分數從74.94%降至35.41%；P2組分的THA為0.37～0.41 ℃，P4組分的THA為0.32～0.41 ℃，均接近沙冬青葉ISPs的0.46 ℃[20]，表明AISPs組分的THA良好。而本研究組實驗前期研究的AISPs混合組分的THA為0.54 ℃[21]，說明分離后AISPs的單一組分的THA有所降低。

2.2.3 AISPs的糖蛋白鑒定結果

圖3 AISPs的糖蛋白鑒定結果Fig.3 Identification of AISPs as glycoprotein

過碘酸可把糖類相鄰2 個碳上的羥基氧化成醛基，用Schiff試劑和醛基反應使糖類呈現紫紅色。如圖3所示，利用Schiff染色法對P2、P4組分進行染色，顯色反應的結果如箭頭處所示：P2組分呈現紫紅色，表明34 kDa組分為糖蛋白；而P4組分無顯色反應，表明52 kDa組分為非糖蛋白。

2.2.4 AISPs的FTIR檢測結果

酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）和酰胺III帶（1 220～1 330 cm-1）是蛋白質的特征譜帶，其振動頻率取決于C＝O和N-H之間的氫鍵性質，為特征振頻率，反映了AISPs 2 個組分的特定二級結構。在酰胺I帶中，1 618～1 640 cm-1為β-折疊；1 650～1 660 cm-1為α-螺旋；1 640～1 650 cm-1為無規卷曲；1 660～1 700 cm-1為β-轉角。從圖4a顯示，由于P2組分的特征峰譜帶相互疊加，1 631 cm-1屬于酰胺I帶的β-折疊的特征峰，采用peakfit軟件對該范圍峰進行分解擬合分析。圖4b的擬合曲線顯示，1 653 cm-1為α-螺旋，1 613、1 635、1 622、1 628 cm-1為β-折疊，1 664 cm-1為β-轉角，1 644 cm-1為無規卷曲。從圖4c顯示，1 641.31cm-1屬于酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）吸收峰，1 641cm-1屬于β-折疊的特征吸收峰；酰胺III帶出現圓頭峰。通過peakfit進行擬合，從圖4d可以看出，1 652.48 cm-1為α-螺旋，1 610.63、1 620.38、1 628.73、1 635.07 cm-1為β-折疊，1 662.48、1 673.77、1 685.39 cm-1為β-轉角，1 642.8 cm-1為無規卷曲。二級結構的檢測結果見表4。

圖4 AISPs組分的FT-IR圖譜及酰胺I帶FTIR擬合圖譜Fig.4 FTIR spectra and AISPs components and curve fitting of amide I band

表4 AISPs P2、P4組分二級結構的檢測結果Table 4 Secondary structure composition of AISPs P2 and P4

從表4得出，AISPs的34 kDa組分的二級結構比例為α-螺旋∶β-折疊∶β-轉角∶無規卷曲=13.19∶60.21∶12.21∶19.16；52 kDa組分的二級結構比例為α-螺旋∶β-折疊∶β-轉角∶無規卷曲16.87∶39.41∶26.69∶17.03。Yu Zhao等[22]采用拉曼光譜對天然SPI的二級結構進行測定，發現其含有較多的β-折疊結構，其含量為55.2%，而α-螺旋結構較少，含量僅為14.4%，這與2.2.4節得到的天然AISPs二級結構的含量相近。

2.3 冷凍濕面筋蛋白持水性與可凍結水含量的變化

2.3.1 冷凍濕面筋蛋白持水率的變化

圖5 －18 ℃不同AISPs添加量下凍藏凍融濕面筋蛋白持水率的變化Fig.5 Changes in water-holding capacity of frozen-thawed wet gluten with different amounts of AISPs added at -18 ℃

圖6 －40 ℃不同AISPs添加量下凍藏凍融濕面筋蛋白持水率的變化Fig.6 Changes in water-holding capacity of frozen-thawed wet gluten with different amounts of AISPs added at -40 ℃

圖5、6對比可知，在-18 ℃和-40 ℃時，添加不同濃度AISPs的凍藏凍融濕面筋蛋白持水率較空白組均有所上升，但-18 ℃的持水率上升幅度較小，說明AISPs在-40 ℃低溫處理時作用效果更為顯著，故后續研究及討論均在-40 ℃進行。

從圖6可以看出，隨著冷凍時間的延長，凍藏和凍融各組的濕面筋蛋白持水率均呈下降趨勢。凍藏和凍融對照在3、5、7 周后，持水率大幅度下降，且凍融處理比凍藏處理的下降幅度更大，說明對濕面筋破壞作用更為顯著。不同添加量的AISPs，不同程度地緩解了下降趨勢，其中，添加0.5%和1% AISPs組的效果明顯高于對照和1.5%組，其中1% AISPs組的總體效果更突出，凍藏組較對照分別提升了3.42%、5.79%、4.85%；凍融較對照分別提升了2.82%、3.39%、6.27%。說明由于溫度波動產生的冰晶重結晶現象進一步破壞了面筋網絡結構，添加AISPs對冷凍濕面筋蛋白的持水性具有保護作用，保護了水分的流失，且不同AISPs添加量、不同冷凍方式對濕面筋蛋白持水率的影響有差異。

2.3.2 冷凍濕面筋可凍結水含量的變化

由圖7可以看出，隨著冷凍時間的延長，凍藏組和凍融組的濕面筋蛋白可凍結水含量均逐漸增加。不同添加量的AISPs，不同程度地緩解了上升趨勢，其中，添加0.5% AISPs組效果最好。在冷凍處理3、5、7 周后，凍藏組較對照分別下降了4.55%、4.49%和4.30%；凍融組較對照分別下降了3.37%、2.17%和3.16%。說明在冷凍過程中，濕面筋中水分發生結晶，其中的半結合水因與高分子物質結合不緊密而發生遷移，小冰晶不斷聚集形成大冰晶，刺破面筋的網絡結構，從而導致持水率下降及水分流失，可凍結水含量增加[23]。而AISPs的添加減緩了可凍結水含量的上升趨勢。說明AISPs可以降低溶液的凝固點，在范德華力、疏水性相互作用和氫鍵作用下吸附到面筋蛋白體系中冰核表面，抑制凍結過程中的冰晶生長和再結晶[24]，減少了冰晶對濕面筋網絡結構的破壞，阻止了水分從面筋網絡結構中離析[25]。

圖7 AISPs對濕面筋凍藏凍融過程中熔化焓值變化的影響Fig.7 Effect of AISPs on the change in melting enthalpy of wet gluten during freezing-thawing process

此外，當AISPs添加量為1.5%時，凍藏1 周時持水率小于對照，5、7 周后，高于對照、卻小于其他添加量；凍融組中雖一直高于對照，卻小于其他添加量。Carpenter[26]和蔡路昀[27]等發現ISPs相對濃度較低時可顯著提高紅細胞的存活率；而較高濃度將致使紅細胞的存活率降低。因此，當AISPs的添加濃度較低，體現出抑制濕面筋體系中大冰晶形成及對面筋蛋白的破壞，有效地鎖住了水分；而AISPs較高濃度時，促進了大冰晶的形成，對濕面筋蛋白的破壞作用開始顯現，導致持水性下降。說明，AISPs的添加量與濕面筋持水性及可凍結水含量的抗凍保護作用存在著一定的量效關系。

2.4 AISPs對冷凍濕面筋蛋白分子質量的影響

采用Quantity One軟件分析圖7中各濕面筋蛋白樣品的電泳條帶及分子質量，結果如圖8所示。

小麥面筋蛋白由麥醇溶蛋白、麥谷蛋白、麥清蛋白及麥球蛋白組成，其中麥醇溶蛋白約占蛋白質總量的50%，其分子質量范圍為30～80 kDa，根據其在低pH值下電泳遷移率的不同可分為α-、β-、γ-、ω-麥醇溶蛋白4 種類型[17]。α-、β-、γ-麥醇溶蛋白的分子質量范圍為30～50 kDa，ω-麥醇溶蛋白的分子質量范圍在45～75 kDa之間。麥谷蛋白約占蛋白質總量的35%～45%，其亞基可分為HMW-GS和LMW-GS。HMWGS可分為X、Y兩種類型，分子質量分別為80～90 kDa和65～75 kDa。LMW-GS可分為B、C、D 3 種類型，C、D型分子質量分別為20～40、50～70 kDa，大多數為B型分子質量為30～40 kDa[28]。麥谷蛋白和麥醇溶蛋白分別決定面團的黏彈性和延展性，對面筋網絡結構、冷凍面團及冷凍面食品的質量產生很大影響。

圖8 凍藏與凍融濕面筋蛋白樣品的分子質量變化趨勢Fig.8 Changes in molecular mass of frozen and freeze-thaw gluten samples

從圖8可以看出，經過凍藏處理的濕面筋蛋白分子質量呈下降趨勢，分子質量范圍在14～70 kDa之間。隨著冷凍時間的延長，65～75 kDa的蛋白組分完全消失，14.4～30 kDa的組分顯著增加。其中，ω-麥醇溶蛋白部分降解，麥谷蛋白HMW-GS全部降解，LMW-GS的B亞基和C亞基較穩定，D亞基有不同程度的增加，尤其在凍藏5 周和7 周時D亞基組分的增加進一步加大。AISPs添加組的濕面筋蛋白組分較對照均有低分子質量組分的不同程度增加，其中0.5% AISPs的濕面筋蛋白分子質量變化較大，如對D亞基分子質量的影響偏大，凍藏3 周時對照組的D亞基分子質量為39.23 kDa，0.5%AISPs的在5 周則增加至47.79 kDa。說明在低溫冷凍破壞了維持HMW-GS和ω-麥醇溶蛋結構的作用鍵，使得蛋白質發生伸展和降解。冰晶的重結晶和水分的重新分布使LMW-GS/HMWGS的比率呈現出較為明顯的增大趨勢[29-30]。

從圖8可以看出，經過凍融處理后的濕面筋蛋白分子質量同凍藏處理的結果，亦呈下降趨勢，總體范圍處在12～60 kDa之間，其中ω-麥醇溶蛋白、麥谷蛋白HMWGS及LMW-GS的B、C、D亞基的變化也同凍藏處理結果相仿。而隨著凍融次數的增加，低分子質量蛋白進一步增加，明顯多于凍藏處理。B、C、D亞基發生了不同程度的增加，其中主要集中在B亞基和C亞基的增加。加入AISPs后，在一定程度上緩解了蛋白組分降解。以AISPs添加量為1%時最佳，此時凍融處理后在35～66.2 kDa分子質量的蛋白顯著增加。Ribotta[31]和Sharadanant[32]等認為冷凍處理不再使低分子質量蛋白發生降解，與本實驗結果有差異。分析原因為加入AISPs后，冰晶的形態被修飾成規則的六邊形狀，對蛋白聚集體的破壞力減弱，從而緩解了高分子蛋白的解聚，且與蛋白質三維網絡結構的物理截留作用存在很大的關系[33-34]。

由圖8可知，經凍融處理后，分子質量為61.26～71.96 kDa的蛋白組分全部降解，經凍融處理濕面筋蛋白全部蛋白組分的分子質量較凍藏低，說明低溫反復凍融對麥谷蛋白聚集體的破壞更為嚴重。但添加AISPs凍融處理的樣品表現出高分子質量解聚與低分子質量聚集的現象有所減緩，說明AISPs對凍融濕面筋蛋白具有一定的抗凍保護作用。

2.5 濕面筋SEM微觀結構表征

由圖9可見，濕面筋蛋白超微結構呈現出多孔的三維立體網絡狀，呈連續纖維狀的為麥谷蛋白聚合體，而較小的麥醇溶蛋白則穿插其中。凍藏1 周時面筋蛋白呈網眼狀緊密相連且蛋白孔洞大小均勻且光滑，表明蛋白結構致密統一，具有較好的穩定性[35]。隨著凍藏時間的延長，面筋蛋白網絡結構中的黑色孔洞逐漸變大，這是由于濕面筋蛋白冷凍時，其中的水分形成冰結晶分布在面筋蛋白基質的各個部位，速凍后冰晶升華成汽體從面筋蛋白中溢出，冰晶體原來所處位置便成為空穴[36]。與同組樣品凍藏條件濕面筋蛋白超微結構相比，凍融條件下，濕面筋蛋白面筋碎片增多，產生了大量不規則孔洞，質地粗糙、面筋纖維束斷裂，說明凍融循環對面筋網絡結構的破壞更大。劉國琴等[37]認為凍融處理會導致溫度發生波動而產生等質量重結晶、遷移重結晶和晶體生長等重結晶現象。此外，凍融處理可引起濕面筋網絡結構物化性質的改變，凍藏凍融處理后的濕面筋蛋白持水性下降，導致組分中游離水增多，可凍結水形成冰晶后體積增加，其異常的膨脹特性使得蛋白質的三維網絡結構受到擠壓而破壞[38]。Kontogiorgos等[39]發現由于水與蛋白質的相互作用，可以增加水合結構中原子-原子間相互作用，高分子質量蛋白質體系如麥谷蛋白，在冷卻過程中會發生玻璃化現象，從而減緩對面筋蛋白網絡結構的損害。說明，低溫凍藏與凍融處理破壞麥谷蛋白HMW-GS后，導致其不同程度的降解，進而加劇了對面筋網絡結構的破壞。SEM結果與本實驗前期對濕面筋蛋白電泳及其分析結果相印證。

圖9 －40 ℃凍藏和凍融處理的濕面筋蛋白超微結構（×1 000）Fig.9 Ultrastructure of frozen and thawed wet gluten at -40 ℃ (× 1 000)

與對照組相比，AISPs的添加均使面筋蛋白微觀結構得到明顯改善。對比不同添加量，當AISPs添加量為1%時，孔壁厚且較為光滑；面筋蛋白的網絡結構重新交聯，孔洞重新排布，使得面筋蛋白網絡支撐力加強。說明AISPs可抑制冰晶形成，使冷凍濕面筋蛋白內外部的可凍結水形成相對較小且均勻的冰晶，對面筋蛋白具有抗凍保護作用，可提高冷凍面制品的品質[40]。

濕面筋蛋白的持水率和可凍結水含量的變化，反映了水分的存在方式和遷移規律，在一定程度上佐證了冷凍條件下，濕面筋蛋白組分的分子質量及SEM網絡表征的變化趨勢。綜上確定，AISPs添加量為1%時，對-40 ℃條件下凍融樣品的抗凍保護效果最優。

3 結 論

AISPs含17 種氨基酸，親水性與疏水性氨基酸的比例為7∶4；對AISPs進行分離后，得到34、52 kDa兩個分離組分，前者為糖蛋白，后者為非糖蛋白；34 kDa組分的THA為0.37～0.41 ℃，52 kDa組分的THA為0.32～0.41 ℃。34 kDa組分的二級結構比例為α-螺旋∶β-折疊∶β-轉角∶無規卷曲=13.19∶60.21∶12.21∶19.16；52 kDa組分的二級結構比例為α-螺旋∶β-折疊∶β-轉角∶無規卷曲=16.87∶39.41∶26.69∶17.03。

在-18 ℃和-40 ℃分別凍藏與凍融處理濕面筋蛋白，顯示添加不同濃度AISPs各組的持水率下降趨勢減緩，且對-40 ℃處理樣品的保護效果更為顯著。

隨著凍藏時間的延長和凍融周期的增加，濕面筋蛋白的持水性呈下降趨勢，可凍結水含量逐漸增加，凍融組均高于凍藏組。添加AISPs后，持水率下降和可凍結水上升趨勢減緩。且AISPs的添加量與濕面筋蛋白持水性及可凍結水含量的抗凍保護作用存在著一定的量效關系。

經電泳和Quantity One軟件分析，隨著凍藏時間的延長，濕面筋蛋白的ω-麥醇溶蛋白部分降解，HMW-GS全部降解，LMW-GS的B亞基和C亞基較穩定，D亞基有所增加；隨著凍融次數的增加，低分子質量蛋白進一步增加，明顯多于凍藏。B、C、D亞基發生了不同程度的增加，主要集中在B亞基和C亞基的增加。加入AISPs后，在一定程度上緩解了蛋白組分降解。并促使低分子質量組分有不同程度增加，其中0.5% AISPs和1% AISPs分別對凍藏和凍融樣品的影響較大。

SEM表征結果顯示，隨著凍藏時間的延長和凍融周期的增加，面筋網絡結構受到破壞，出現大量不規則、質地粗糙的孔洞。AISPs的添加使濕面筋網絡得以清晰連續。