pH值對米糠清蛋白和球蛋白的結構、溶解性及表面疏水性的影響

楊 健，富天昕，張 舒，馮玉超，王長遠,,

（1.國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319）

米糠是稻米加工的副產品，其營養物質豐富，是我國一種量大面廣的可再生資源。米糠蛋白生物效價高，其中必需氨基酸的組成平衡合理[1]，接近FAO/WHO推薦模式，是公認的優質植物蛋白質[2]。米糠蛋白組分復雜，溶解性較差，所以其加工性能差，米糠分離蛋白的提取率低、產品的功能性質不佳，極大地限制了米糠蛋白的工業化生產[3-4]，因此米糠蛋白質的提取和改性工作成為研究的重點。堿溶法是提取米糠蛋白的適合方法[5-7]，說明pH值對米糠蛋白的提取影響較大。pH值的改變不僅會影響蛋白質的帶電性質，改變蛋白質功能基團的電離作用，還會影響蛋白質之間的相互作用，從而影響蛋白質的溶解性及其他功能性質。因此了解米糠蛋白質的功能性質以及結構隨pH值變化的規律，有利于米糠蛋白的提取，以及在生產過程中對食品感官特性的保護和營養價值的保留。王長遠等[8]利用不同pH值的緩沖液處理米糠蛋白發現，pH值對米糠蛋白的熒光光譜有一定影響，并且在酸性環境中，米糠蛋白的亞基組成變化明顯。另外，蛋白質結構相關研究方法中，改變蛋白溶液的pH值是常用技術之一，當介質的pH值處于蛋白質等電點附近發生變化時，電荷斥力有所增加，迫使蛋白分子發生部分展開。有研究表明，經過不同pH值處理后，蛋白質結構及其相關功能特性會發生顯著改善[9]。

米糠蛋白可分為清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白，其中清蛋白和球蛋白的含量所占比重達73%[10]，因此將其作為本研究的2 個目標蛋白。研究pH值對米糠清蛋白和球蛋白結構、溶解性及表面疏水性影響，有利于了解米糠蛋白亞基組分和空間構象與其加工處理條件的關系，對解決米糠蛋白提取率不高、加工性能不佳等問題具有指導意義，也為今后開發米糠蛋白產品的高效提取分離及加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料米糠購自黑龍江省農墾總局查哈陽農場（水稻品種為空育131）；米糠清蛋白、球蛋白為實驗室自制。

Lowry法蛋白質含量測定試劑盒 上海荔達生物科技有限公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、三(羥甲基)氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris）、過硫酸銨、四甲基乙二胺、β-巰基乙醇、尿素美國Sigma公司；蛋白Marker（SM0431） 加拿大富酶泰斯公司。

1.2 儀器與設備

1100 型氨基酸自動分析儀 美國Agilent公司；Mini-Protean 4電泳儀 美國Bio-Rad公司；ZetaPALS-激光粒度分析儀、ZetaPALS-Zeta電位儀 美國布魯克海文儀器公司；AKTA-蛋白質純化儀 美國GE公司；PE Pyris6差示掃描量熱儀 美國Pulus TA.XT公司。

1.3 方法

1.3.1 原料米糠的脫脂處理

取原料米糠過60 目篩，按照1∶10（V/V）加入正己烷，室溫下不斷攪拌脫脂4 h，其間換正己烷（石油醚）2～3 次，4 000 r/min離心10 min，上清液用蒸餾法回收正己烷，脫脂后將米糠置于通風櫥中揮發48 h，脫脂米糠粉裝入具塞試劑瓶中，置于冰箱4 ℃保存備用。

1.3.2 米糠蛋白組分提取及含量測定

采用Osbrone方法[11]提取米糠中的清蛋白和球蛋白。在室溫下，將100 g脫脂米糠與0.4 mol/L的NaCl溶液按1∶5（g/mL）的料液比混合，磁力攪拌1 h，4 500 r/min離心15 min，收集上清液，沉淀重復提取1 次，將2 次提取的上清液合并后抽濾，在4 ℃對蒸餾水透析48 h后離心，上清液為清蛋白，沉淀為球蛋白，冷凍干燥，所得蛋白干粉于-20 ℃冷凍保存備用。用Lowry法測定提取液中蛋白質含量[12]。

1.3.3 米糠蛋白亞基組成的測定

參考Laemmli[13]的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）不連續電泳方法。分離膠質量分數為12%，濃縮膠質量分數為4%。蛋白質質量濃度為1 mg/mL，上樣量10 μL，電泳前在95 ℃加熱5 min。電泳開始時電流為10 mA，樣品進入分離膠后為20 mA。染色劑為0.1%考馬斯亮藍R-250，脫色劑為（甲醇-冰乙酸-水（4∶1∶5，V/V））混合溶液。

1.3.4 米糠清蛋白及球蛋白的不同pH處理

配制10 mmol/L pH 2的甘氨酸-鹽酸緩沖液，pH 4～6的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH 7～9的Tris-HCl緩沖液，pH 11的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（0.05 mol/L）。準確稱取一定量的蛋白質樣品，溶于不同pH值（按照蛋白的等電點，共設計5 個pH值梯度）的緩沖液中，調節各溶液終質量濃度到1 mg/mL，室溫下放置一定時間后，冷凍干燥，所得蛋白樣品干粉于-20 ℃冷凍保存備用。

1.3.5 溶解性的測定

參考張相倫[14]的方法，用氮溶解指數（nitrogen solubility index，NSI）表示溶解性。稱取100 mg蛋白樣品分散于10 mL的去離子水中，磁力攪拌30 min，20 ℃、12 000×g離心20 min。上清液經適度稀釋，采用Lowry法測定蛋白質含量，以牛血清白蛋白為標準物繪制標準曲線。氮溶解指數計算如下：

1.3.6 表面疏水性的測定

采用8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）熒光探針參考周麟依等[15]的方法對米糠蛋白組分進行表面疏水性測試。ANS標記液濃度為8 mmol/L，依據濃度梯度法建立熒光強度-底物濃度線性關系，進而確定蛋白質表面疏水性。

1.3.7 流體動力學半徑及其分布的測定

采用ZetaPlus粒度分析儀測定米糠蛋白的流體動力學半徑及其分布徑。將米糠蛋白樣品用50 mmol/L pH 7.0的磷酸緩沖液稀釋蛋白質質量分數至0.2%。過0.45 μm醋酸纖維膜（水系），于室溫進行測量，取3 次測量的平均值[16]。

1.3.8 Zeta電位的測定

將米糠蛋白樣品用50 mmol/L pH 7.0的磷酸緩沖液稀釋蛋白質質量分數至0.2%。上樣體積為1 mL，測定溫度為25 ℃。重復測量6 次，計算平均值為測定值[16]。

1.3.9 圓二色譜（circular dichroism，CD）的測定

參考Greenfield[17]和張濤等[18]的方法。采用遠紫外區域CD研究不同品種蛋白的二級結構。掃描波長范圍200～250 nm，（25±1）℃，掃描速率為100 nm/min，樣品池光程為0.1 nm，靈敏度為100 mdeg/cm。米糠蛋白質量濃度為0.4 mg/mL，用pH 7.0，0.01 mol/L的磷酸緩沖液配制。用平均摩爾橢圓率（θ）表示CD數據，單位為deg·cm2/dmol。通過CDPRO軟件分析CD色譜圖數據，使用的算法為CONTIN/LL，使用的參考蛋白為SMP56，取蛋白平均殘基含量為115 g/mol，計算波長范圍為200～240 nm，計算α-螺旋、β-折疊、β-轉角與無規卷曲的含量[19]。

1.3.10 拉曼光譜的測定

將米糠蛋白粉末直接平鋪在載玻片上進行拉曼測定，激發光波長為785 nm，激光功率為300 mW，掃描范圍400～2 000 cm-1，每次掃描時間60 s，積分10 次，4 次掃描進行累加[20]。以苯丙氨酸（1 003 cm-1）作為歸一化因子，得到米糠蛋白的拉曼光譜。

1.3.11 氨基酸組成的測定

參考黃友如[21]的酸水解方法。首先將蛋白樣品經氯仿-甲醇（2∶1，V/V）的混合溶液進行脫脂處理，然后將蛋白樣品置于水解管中，加入6 mol/L的鹽酸溶液，在110 ℃密閉條件下水解1 d，冷卻后定容、過濾、蒸干，再加入0.02 mol/L的鹽酸溶液，在真空中放置30 min，采用1100型氨基酸自動分析儀測定除色氨酸以外的其他氨基酸的含量。

1.3.12 酪氨酸殘基分子數計算

本實驗利用式（2）和式（3）進一步精確地計算分子內部包埋和分子表面暴露的酪氨酸殘基分子數N[22]。

由于方程適用于I850/I830比值為0.5～1.25，對實驗測定結果計算發現比值符合上述范圍，故采用上述方程進行計算分析。

1.4 數據統計及分析

每個實驗重復3 次，數據統計分析采用SPSS 20.0軟件對數據進行ANOVA差異顯著性分析，P＜0.05為顯著性差異。采用Origin 8.0軟件、PeakFit 4.12軟件、CDPro軟件包分析等進行圖譜分析處理和圖表制作。

2 結果與分析

2.1 米糠成分的測定

表1 米糠基本化學組成分析Table 1 Chemical components of rice bran%

由表1可知，新鮮米糠中脂肪質量分數為26.7%，經正己烷脫脂后米糠的脂肪質量分數為3.92%，脫脂率為85.31%。脫脂后蛋白質質量分數高達15.76%，高于精白米本身的蛋白質質量分數（6%～10%）[23-25]，可見脫脂米糠是大米加工的副產品，是良好的植物蛋白資源。

2.2 米糠清蛋白、球蛋白的檢測

Lowry法[12]測定提取液中蛋白質含量結果表明，在脫脂米糠中球蛋白提取率為30.5%，清蛋白提取率為34.6%；球蛋白的蛋白質純度為78.2%，清蛋白的蛋白質純度為65.7%。

2.3 米糠清蛋白、球蛋白的SDS-PAGE分析

由圖1可以看出，米糠清蛋白主要亞基的分子質量分布于32、31、22、17、14 kDa，以及部分大于35 kDa的亞基歸屬譜帶；米糠球蛋白主要亞基的分子質量分布于63、53、49、36、21 kDa。可見清蛋白和球蛋白均以中小分子質量的亞基為主。蘇慧敏等[24]研究結論表明，米糠中清蛋白、球蛋白的分子質量范圍分別為10～100、10～153 kDa；王艷等[25]提取制備的谷蛋白電泳分析結果表明，酸性亞基的分子質量為8.9～31.0 kDa，堿性亞基為21.1～23.9 kDa，且存在少量分子質量＞58 kDa和＜14 kDa的組分，并推測這些大分子是清蛋白和球蛋白，而小分子是醇溶蛋白；還有研究指出大米清蛋白分子質量為60 kDa，大米球蛋白12～20 kDa[26]，與本實驗結果一致。

圖1 米糠清蛋白和球蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE profile of rice bran protein concentrate and its components

2.4 pH值對米糠清蛋白及球蛋白溶解性的影響

圖2 pH值對米糠清蛋白及球蛋白溶解性的影響Fig.2 Effect of pH on solubility of rice bran albumin and globulin

如圖2所示，隨著pH值的增加，米糠清蛋白及球蛋白溶解性總體均呈現先下降后上升的趨勢。當pH值為4時，清蛋白的溶解度最低，當pH值在4～5左右時，球蛋白的溶解度最低，此時2 種米糠蛋白均接近自身的等電點，從而使得溶解度變差。但可發現，米糠清蛋白在等電點附近的溶解性要顯著高于米糠球蛋白的溶解性。這種溶解度的變化反映了酸堿處理對蛋白質二、三級構象的改變作用[27-28]。有研究指出，米糠蛋白溶解性較差的原因在于米糠蛋白結合了植酸、纖維素和其他成分[29]，而堿性環境對植酸、纖維素等組分的部分降解作用可弱化其對米糠蛋白結合作用，增強米糠球蛋白及清蛋白的溶解性。

由于pH＜6時，米糠清蛋白及球蛋白的溶解性都較差，因此在接下來的研究中，選取pH 7～11條件下溶解性相對較好的樣品作為研究對象。

2.5 pH值對米糠球蛋白及清蛋白表面疏水性的影響

圖3 pH值對米糠清蛋白及球蛋白表面疏水性的影響Fig.3 Effect of pH on surface hydrophobicity of rice bran albumin and globulin

由圖3可知，米糠清蛋白與球蛋白的表面疏水值均隨著pH值的增大呈上升趨勢，且清蛋白表面疏水值要顯著大于球蛋白的表面疏水值。在pH值為7～7.25之間時，米糠球蛋白的表面疏水值略大于清蛋白，隨著pH值的增大，米糠清蛋白的表面疏水性逐漸大于米糠球蛋白。由此推測，米糠清蛋白在堿性條件下隨著pH值增加而呈現的表面疏水性增大主要與清蛋白亞基解離有關。另外，堿性處理可以導致植酸的解離，使得蛋白分子結構更易展開，增加疏水性[30]。

2.6 pH值對米糠清蛋白及球蛋白粒徑分布的影響

圖4 pH值對米糠清蛋白及球蛋白粒徑分布的影響Fig.4 Effect of pH on particle size distribution of rice bran albumin and globulin

由圖4可知，米糠清蛋白的表觀流體力學直徑分布平均值為134.3 nm，米糠球蛋白表觀流體力學直徑分布平均值為484.7 nm，并整體呈單粒徑峰分布。隨著pH值的增加，米糠清蛋白和球蛋白的流體動力學直徑分布均呈降低趨勢，米糠清蛋白的主峰逐漸解離呈2 個并肩粒徑峰，而球蛋白的主粒徑峰逐漸減小，并同步形成了一個20～70 nm的粒徑分布峰。這主要是由于堿性環境下米糠球蛋白及清蛋白均發生了亞基解離，并明顯表現為大粒徑聚集體粒子降解形成更多的小粒徑粒子，故而隨著pH值的增加米糠清蛋白及球蛋白呈降低的變化趨勢。清蛋白5 000 nm的粒徑峰向低粒徑方向移動，而球蛋白在此位置的粒徑峰并未發生明顯變化。由此可以推測，米糠清蛋白歸屬于可溶性聚集體的大粒徑峰部分解離為小粒徑亞基，而球蛋白的可溶性聚集體解離現象并不顯著。推測堿性條件下米糠清蛋白及球蛋白亞基解離是溶解性提高的原因之一。

2.7 pH值對米糠清蛋白及球蛋白Zeta電位的影響

在米糠蛋白分子側鏈包含許多極性基團和非極性基團。在水溶液中，米糠蛋白的親水基團暴露在蛋白表面，從而使蛋白質表面帶有電荷。蛋白質表面氨基酸所帶電荷的多少和電荷的正負性影響著蛋白質表面電位，從而影響了蛋白質溶液的Zeta電位值。一般來說，蛋白質表面帶正電荷的氨基酸多于帶負電荷的氨基酸時，蛋白質溶液Zeta電位為正值；反之，蛋白表面帶負電荷的氨基酸多于帶正電荷的氨基酸時，蛋白質溶液Zeta電位為負值[28]。由圖5可知，隨著pH值的增大，米糠球蛋白及清蛋白Zeta電位絕對值均呈增大的變化趨勢。這是由于Zeta電位絕對值越大，表面所帶的負電荷越多，更多的同性電荷間的相互排斥會使蛋白質溶液更穩定，蛋白的聚沉減少，蛋白質溶解度變大，因此米糠蛋白Zeta電位絕對值的增大是米糠蛋白溶解性增加的原因之一。

圖5 pH值對米糠清蛋白及球蛋白Zeta電位的影響Fig.5 Effect of pH on zeta potential of rice bran albumin and globulin

2.8 pH值對米糠球蛋白及清蛋白結構影響的CD分析

表2 pH值對米糠清蛋白二級結構影響Table 2 Effect of pH on secondary structures of rice bran albumin%

表3 pH值對米糠球蛋白二級結構影響Table 3 Effect of pH on secondary structures of rice bran globulin%

由表2、3可知，米糠清蛋白隨著pH值升高，α-螺旋含量呈逐漸增大，β-折疊則逐漸降低，無規卷曲含量逐漸增大，而米糠球蛋白隨著pH值的升高，其主要的二級結構單元含量未發生顯著變化。球蛋白中多數二級結構為無規卷曲和分子內的大量反β-折疊，而清蛋白多為α-螺旋和分子內有序的β-折疊。可見米糠蛋白的二級結構與很多植物蛋白相似，即含有較少的α-螺旋，大量的β-折疊和無規卷曲[28]。

2.9 pH值對米糠球蛋白及清蛋白結構影響的拉曼光譜分析

譜線參比苯丙氨酸進行歸一化處理，通過比對歸一化譜線強度，分析確定對應基團的微環境及分子構象變化[31]。如圖6所示，隨著pH值增大，米糠球蛋白α-螺旋及β-轉角含量均未變化，但卻發生由β-折疊向無規卷曲的部分轉變。由此可知米糠球蛋白在實驗條件下二級結構較為穩定，而清蛋白二級結構單元發生了由β-折疊向α-螺旋與無規卷曲的轉變。米糠清蛋白在拉曼光譜分析中盡管各結構單元組分含量與CD的結果有所出入，但變化規律均相似。

圖6 pH值對米糠球蛋白及清蛋白結構影響的拉曼光譜分析Fig.6 Effect of pH on Raman spectra of rice bran albumin and globulin

2.10 pH值對主鏈結構影響的分析

米糠蛋白的二級結構組成主要由酰胺I帶確定，酰胺I帶拉曼特征峰位置為：α-螺旋1 645～1 660 cm-1；β-折疊1 665～1 680 cm-1；β-轉角1 680～1 690 cm-1；無規卷曲1 660～1 670 cm-1[32-33]。由表4、5基于拉曼光譜酰胺I帶擬合分析得出的米糠球蛋白及清蛋白二級結構結果可以看出，在所測范圍內，隨著pH值的增大，米糠球蛋白α-螺旋及β-轉角含量均無顯著變化（P＞0.05），而β-折疊含量降低趨勢，無規卷曲含量呈增大趨勢。與CD的結果相比有所差異，這種構象的轉變可能與堿性條件下亞基解離有關。

表4 利用酰胺I帶擬合米糠清蛋白二級結構結果Table 4 Contents of secondary structures of rice bran albumin determined by amide I band curve fitting%

表5 利用酰胺I帶擬合米糠球蛋白二級結構結果Table 5 Contents of secondary structures of rice bran globulin determined by amide I band curing fitting%

2.11 pH值對側鏈結構影響的分析

表6 米糠蛋白及4 種蛋白的氨基酸組成分析Table 6 Amide acid composition of rice bran albumin and globulin%

如表6所示，米糠清蛋白中的極性中性氨基酸相對含量最低（15.1%），其他類型的氨基酸含量適中；米糠球蛋白含有較高的堿性氨基酸（22.0%），非極性氨基酸相對含量最少（40.0%）。以上氨基酸分析結果與Hudsona[34]報道的結果較為相似。

表7 pH值對米糠清蛋白側鏈結構的影響Table 7 Effect of pH on side chains of rice bran albumin

表8 pH值對米糠球蛋白側鏈結構的影響Table 8 Effect of pH on side chains of rice bran globulin

由表7、8可知，在所測pH值條件下米糠球蛋白及清蛋白的酪氨酸殘基趨向于“暴露式”，結合對殘基暴露與包埋分子數看出，酪氨酸殘基較多暴露于分子的表面，并作為氫鍵的供體或受體與水相互作用。隨著pH值的增大，米糠清蛋白及球蛋白的酪氨酸費米共振線I850/I830及殘基暴露與包埋分子數的比值均未發生顯著變化（P＞0.05）。

760 cm-1附近的拉曼譜帶歸屬為色氨酸側鏈，隨著pH值的增大，米糠清蛋白和球蛋白色氨酸側鏈歸屬譜帶強度均呈下降趨勢，Surewicz等[35]研究表明760 cm-1附近區域的拉曼峰強度降低與色氨酸殘基由原本“包埋式”轉變為“暴露式”有關。還有研究表明蛋白質變性造成的結構解折疊常會引起色氨酸殘基的暴露，在拉曼譜圖中表現為色氨酸譜帶強度的降低[36-37]。結果表明，隨著pH值的增大，米糠清蛋白及球蛋白結構趨于“暴露”態。說明米糠清蛋白及球蛋白隨著pH值的增高亞基解離相伴形成的分子結構解折疊以及堿性pH值對穩定米糠蛋白內部結構作用力的弱化作用使得在堿性pH值誘導下色氨酸殘基更趨于“暴露”態。

3 結 論

本研究通過蛋白質化學理論和譜學分析技術手段探究了pH值對米糠清蛋白及球蛋白結構、溶解性及表面疏水性的影響。隨著pH值的增大，米糠清蛋白、球蛋白的流體動力學直徑分布均呈降低趨勢，米糠清蛋白歸屬于可溶性聚集體的大粒徑峰部分解離為小粒徑亞基，而球蛋白的可溶性聚集體解離現象不顯著；米糠球蛋白、清蛋白Zeta電位絕對值均呈增大的趨勢。進一步得出，pH值的改變影響著米糠清蛋白中α-螺旋、β-折疊以及無規卷曲結構的含量；米糠清蛋白及球蛋白的色氨酸殘基趨近于“暴露”態。最終在堿性條件下，米糠球蛋白保留了大部分二級結構、亞基解離誘導的蛋白質三級結構解折疊小幅提高了其表面疏水性；而米糠清蛋白的二級結構單元的無序性轉變、亞基解離誘導的蛋白結構解折疊卻增大了其表面疏水性；亞基解離成小粒徑以及堿性條件賦予米糠蛋白電荷增加了米糠清蛋白及球蛋白的溶解性。