釀酒酵母環(huán)核苷酸磷酸二酯酶1的異源表達、分離純化與活性檢測

陳 瀅，李赤霞，陳玉娟，田元元，張 萌，韓瀠儀，王友升

（北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京工商大學輕工科學技術(shù)學院，北京 100048）

環(huán)核苷酸磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）能夠催化生物體內(nèi)環(huán)核苷酸水解，通過調(diào)節(jié)生物體內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和腺嘌呤核糖核苷酸（adenosine monophosphate，AMP）的比濃度，進而調(diào)節(jié)由環(huán)核苷酸所調(diào)控的生物體內(nèi)多種生理代謝過程[1]。該酶對細胞生命活動起著極其重要的作用。目前研究表明，人體內(nèi)的PDE能夠?qū)π哪X血管疾病[2-3]、炎癥[4]、視覺傳導[5]等生理性疾病起到調(diào)控和治療的作用，于是PDE作為一種治療靶點進入研究者的視線[6]。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在食品工業(yè)中有非常重要的地位，廣泛應(yīng)用于釀酒工業(yè)、發(fā)酵食品、能源化工業(yè)、酵母食品以及生物防治等領(lǐng)域[7-8]。如吳軒德等[9]利用醋酸桿菌優(yōu)化S.cerevisiae在白酒的釀造中產(chǎn)生乙酸乙酯的過程；陳安特等[10]利用S.cerevisiae優(yōu)化蘿卜泡菜的發(fā)酵過程，證明S.cerevisiae能夠抑制泡菜過度酸化，并能產(chǎn)生酯類香氣；李強等[11]在桑葚中篩選出1 株S.cerevisiae，對葡萄采后的黑曲霉病有較好的防治效果。此外，基因組測序結(jié)果顯示，S.cerevisiae與人類基因具有約23%的同源性，許多與人類細胞代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)如細胞周期蛋白、信號蛋白等都已在酵母中發(fā)現(xiàn)其相應(yīng)的同源物[12-13]。

目前，已在S.cerevisiae中發(fā)現(xiàn)了兩種PDE，分別是低親和力的cAMP PDE1和高親和力的cAMP PDE2[14]。其中有研究表明S.cerevisiae PDE1基因的缺失，對S.cerevisiae發(fā)酵的磨盤柿子果酒的抗氧化能力和揮發(fā)性物質(zhì)有一定的影響[15]。但是，目前對于S.cerevisiaePDE1生物活性的報道較少，且對于如何獲得大量高純度的S.cerevisiaePDE1蛋白也沒有相關(guān)報道。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，分離純化技術(shù)的不成熟成為限制重組蛋白應(yīng)用的主要因素[16]。

本研究選擇大腸桿菌（Escherichia coli）作為表達載體，將聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增出的S.cerevisiae PDE1基因片段轉(zhuǎn)入其中，誘導表達以獲得大量的目的蛋白，并運用多種純化方法對目的蛋白進行純化。目前實驗室中使用較為廣泛的是親和系統(tǒng)純化，如鄧學天等[17]應(yīng)用Ni柱純化其表達的TNF-α蛋白，獲得較高純度的目的蛋白；王博達等[18]通過Ni柱親和層析獲得4.6 倍純度的解淀粉芽孢桿菌凝乳酶，且能夠達到66.51%的回收率。Q-Sepharose純化系統(tǒng)是應(yīng)用離子交換原理進行蛋白純化的一種手段，有學者應(yīng)用Q-Sepharose純化從白腐真菌發(fā)酵液中純化一種新的漆酶，純化效果良好[19]。分子篩純化系統(tǒng)是利用分子質(zhì)量的大小進行純化的一種方式，金昊[20]應(yīng)用Ni柱、離子交換柱和分子篩對MCUR1蛋白進行純化，得到高純度蛋白，且蛋白能夠應(yīng)用于蛋白結(jié)晶。本研究采用以上3 種不同的純化系統(tǒng)，依次對表達的目的蛋白進行親和層析、離子交換柱和分子篩的純化，目的是得到高純度的重組目的蛋白，并進一步研究S.cerevisiaePDE1蛋白的生物活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌體與質(zhì)粒

野生型S.cerevisiae、E.coli感受態(tài)細胞BL21、DH5α、質(zhì)粒pET28a和pGEM-T，均為本實驗室保存。

1.1.2 試劑

T4 DNA連接酶、DNA聚合酶、NheI內(nèi)切酶、EcoRI內(nèi)切酶 美國Biolab公司；DNA凝膠電泳回收試劑盒（純化回收DNA片段）、高純度質(zhì)粒小量提取試劑盒 美國Thermo公司；Ni-NTA agarose 德國Qiagen公司；Q-Sepharose Fast Flow、Sephacryl S200美國GE Healthcare公司；胰蛋白胨、酵母浸粉 中國北京奧博星生物技術(shù)有限公司；氯化鈉 北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

French Press高壓破碎儀 美國Glen Mills公司；層析柜 生工生物工程（上海）股份有限公司；JP61M/HV-85高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司；恒溫搖床 哈爾濱東聯(lián)電子儀器廠；model868 pH計、A2凈化工作臺 美國Thermo公司；5810R高速離心機 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建

根據(jù)S.cerevisiaePDE1基因序列（NCBI Gene ID:852644）設(shè)計引物，該基因編碼序列全長為1 110 bp。上游引物序列：5’-TCGGCTAGCATGGTTGTATTCGAAAT AA-3’；下游引物序列：5’-TCGGAATTCTTATAGAAAC AAAGTGTGGC-3’。下劃線序列分別為NheI和EcoRI的酶切位點，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。利用NheI和EcoRI限制性內(nèi)切酶對pGM-T-S.cerevisiae PDE1進行雙酶切并回收目的基因產(chǎn)物。T4連接酶將目的基因產(chǎn)物與pET28a質(zhì)粒構(gòu)建pET28a-S.cerevisiae PDE1重組質(zhì)粒并進行DNA電泳純化后雙酶切驗證。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細胞，并選取陽性單克隆菌在含有50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，將菌液進行測序鑒定（UNC-CH Genome Analysis Facility）。

1.3.2 重組pET28a-S.cerevisiaePDE1質(zhì)粒的誘導表達

將獲得的pET28a-S.cerevisiae PDE1重組質(zhì)粒熱激法轉(zhuǎn)入到E.coliBL21感受態(tài)細胞中，并接種到含有50 μg/mL卡那霉素和30 μg/mL氯霉素的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12～16 h后，接種至含有50 μg/mL卡那霉素、30 μg/mL氯霉素和0.4%葡萄糖的2×YT培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)至A600nm為0.7，加入0.1 mmol/L異丙基硫代半乳糖苷低溫誘導（15 ℃）48 h[21]。離心收集菌體。分別對誘導前、誘導24 h和48 h表達菌體測定A600nm值，并按照等菌體量進行取樣，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。

1.3.3 蛋白純化

1.3.3.1 菌體破碎

收集的表達菌體使用提取液按照1∶100的比例重新懸浮，F(xiàn)rench Press高壓（壓力1 200 psi）破碎菌體并對獲得的細胞破碎液分別取樣，即破碎總蛋白、離心上清蛋白和離心沉淀蛋白，并進行SDS-PAGE檢測。

1.3.3.2 基于重組蛋白多重性質(zhì)的分離純化

將離心后的上清蛋白上樣至Ni-NAT柱中進行吸附和洗脫并收集目的蛋白[22]，將Ni-NAT柱純化后的S.cerevisiaePDE1蛋白加入2.5 mmol/L CaCl2、0.5 U/mL牛凝血酶，25 ℃、150 r/min條件下酶切2 h，切除目的蛋白的His-Tag。將酶切后的蛋白樣品進行Q-Sepharose分離純化[23]，并將收集的蛋白濃縮到10 mL以下再進行Sephacryl S200柱分離純化[24]，Ni-NAT、Q-Sepharose和Sephacryl S200分離純化的蛋白均進行SDS-PAGE分析并測定其A280nm值，定義A280nm等于1時的蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL，最終蛋白濃縮至10 mg/mL并冷凍保存。

1.3.4S.cerevisiaePDE1蛋白酶活性測定

參照Wang Huanchen等[25]方法：98 μL assay buffer（20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5；4 mmol/L MnCl2，3H-cAMP（1∶100稀釋），1 mol/L二硫蘇糖醇）加2 μLS.cerevisiaePDE1蛋白，反應(yīng)15 min后，加入0.2 mol/L ZnSO4溶液終止反應(yīng)，再加入0.25 mol/L的Ba(OH)2溶液，離心10 min后，吸取上清液加入到30% ScintiSafe測定酶活性[25]。同時，測定5 個不同濃度下的S.cerevisiaePDE1蛋白對于cAMP和環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）的底物轉(zhuǎn)化酶活性數(shù)據(jù)，按下式計算對兩種底物的轉(zhuǎn)化率：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用凝膠成像儀對電泳圖進行分析。采用GraphPad Prism 5進行非線性回歸得到Michaelis-Menten方程曲線，并計算R2。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建

S.cerevisiae PDE1PCR擴增的目的基因片段通過膠回收和酶切后，電泳結(jié)果見圖1。可以看出目的基因PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后在3 000 bp和1 000 bp左右均出現(xiàn)單一條帶，其中3 000 bp處為載體pGM-T條帶，1 000 bp處為目的基因條帶，從結(jié)果中能夠證明該PCR擴增產(chǎn)物分子質(zhì)量符合預期，并且酶切成功。

圖1 S.cerevisiae PDE1基因PCR產(chǎn)物酶切后DNA電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of PCR products of S.cerevisiae PDE1 gene after enzymatic digestion

圖2 pET28a-S.cerevisiae PDE1基因重組質(zhì)粒基因酶切后DNA電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of recombinant plasmid of pET28a-S.cerevisiae PDE1 after enzymatic digestion

目的基因酶切產(chǎn)物與質(zhì)粒酶切產(chǎn)物連接成重組pET28a-S.cerevisiae PDE1質(zhì)粒，并進行DNA電泳，酶切后膠回收。如圖2所示，重組質(zhì)粒酶切后出現(xiàn)2 條帶，其中6 000 bp處是載體pET28a的基因條帶，1 000 bp處與S.cerevisiaePDE1目的基因預期片段大小一致。對重組質(zhì)粒進行核苷酸測序鑒定，結(jié)果表明重組質(zhì)粒的插入序列與PDE1目的基因一致，證明S.cerevisiae PDE1基因重組質(zhì)粒載體構(gòu)建成功。

2.2 重組pET28a-S.cerevisiae PDE1質(zhì)粒的誘導表達

圖3 S.cerevisiae PDE1蛋白菌體不同時間取樣SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE electrophoresis of S.cerevisiae PDE1 protein at different time points of induction

15 ℃誘導培養(yǎng)48 h后，共收獲蛋白菌體5.5 g/L。在誘導前、誘導24 h和48 h后分別取樣，進行SDS-PAGE。由圖3可知，隨著誘導時間的延長，目的蛋白表達量隨之提高，分子質(zhì)量在30～45 kDa之間的蛋白含量增加迅速，這與S.cerevisiaePDE1蛋白的預期分子質(zhì)量（約40 kDa）相符。該結(jié)果表明，在該誘導條件下能夠獲得大量的S.cerevisiaePDE1蛋白。

2.3 重組蛋白的分離純化

2.3.1 菌體破碎與Ni-NAT柱分離純化

為判斷S.cerevisiaePDE1蛋白的水溶性和結(jié)合Ni-NAT柱的能力，確保后期能夠更好地進行分離純化。對菌體破碎后總蛋白、離心后上清蛋白和沉淀蛋白分別取樣，進行SDS-PAGE，結(jié)果如圖4a所示。S.cerevisiaePDE1表達菌體細胞破碎后，上清液中蛋白含量比較少，表明該蛋白誘導表達主要為包涵體。然而上清液表達蛋白結(jié)合Ni-NAT柱的能力較好。如圖4b所示，上清液表達蛋白和Ni-NAT柱結(jié)合時目的條帶在總條帶中比例達到70%以上，說明該上清液蛋白能通過Ni-NAT柱親和層析進行初步分離純化，且產(chǎn)率較高。經(jīng)過Ni-NAT柱的純化，雜蛋白含量明顯減少，其中最主要的雜蛋白分子質(zhì)量約為60 kDa。

圖4 S.cerevisiae PDE1細胞破碎取樣（a）及Ni-NAT柱純化取樣（b）SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE analysis of S.cerevisiae PDE1 from disrupted cells (a)and its purified product by nickel affinity column chromatography (b)

2.3.2 蛋白酶切及Q-Sepharose柱純化

為切除S.cerevisiaePDE1蛋白的His-Tag標簽，使其能夠更好地與Q-Sepharose柱結(jié)合，對Ni-NAT柱純化后的蛋白進行酶切處理，而后利用Q-Sepharose系統(tǒng)進行第2次純化。對Q-Sepharose系統(tǒng)純化的蛋白取樣進行SDSPAGE分析，結(jié)果如圖5所示。能看出經(jīng)過Q-Sepharose系統(tǒng)純化蛋白的純度增加，雜蛋白條帶減少，但是E.coli蛋白條帶依舊未完全除去。

圖5 S.cerevisiae PDE1蛋白過Q-Sepharose柱純化后SDS-PAGEFig.5 SDS-PAGE analysis of S.cerevisiae PDE1 protein after purification by Q-Sepharose column chromatography

2.3.3 蛋白濃縮及Sephacryl S200柱純化

經(jīng)Q-Sepharose柱純化的蛋白離心濃縮至11 mL，上樣至Sephacryl S200柱純化。取樣SDS-PAGE結(jié)果見圖6a，經(jīng)過Sephacryl S200柱的純化，E.coli蛋白條帶已基本去除，證明經(jīng)過Sephacryl S200分子篩的純化，目的蛋白的純度得到了進一步的提高。將純化后的蛋白濃縮取樣，進行非變性凝膠電泳，結(jié)果見圖6b，目的蛋白能夠進入非變性凝膠，未出現(xiàn)凝聚現(xiàn)象，且?guī)缀醪缓嗑垠w蛋白。至此，經(jīng)過3 次純化后，獲得了高純度的目的蛋白，且能夠保持其相應(yīng)的結(jié)構(gòu)及生物活性。

圖6 S.cerevisiae PDE1蛋白Sephacryl S200柱純化SDS-PAGE（a）及非變性凝膠電泳（b）結(jié)果Fig.6 SDS-PAGE (a) and non-denaturing gel electrophoresis (b) of S.cerevisiae PDE1 protein after purification by S200 column chromatography

2.3.4S.cerevisiaePDE1蛋白酶活性分析

表1 S.cerevisiae PDE1蛋白原液酶活性Table 1 Enzymatic activity of S.cerevisiae PDE1

對純化后的PDE1蛋白進行酶活性測定，如表1所示，PDE1蛋白活性較高，對cAMP的水解率到90%以上。進一步證明經(jīng)3 次純化后重組目的蛋白能夠保持其原有的生物學特性。為驗證S.cerevisiaePDE1蛋白是一種能夠同時水解cAMP和cGMP的酶，通過不同質(zhì)量濃度的蛋白水解兩種底物的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率進行線性分析，結(jié)果如圖7所示。隨著蛋白質(zhì)量濃度的升高，底物轉(zhuǎn)化率也升高，且具有一定的線性關(guān)系。結(jié)果證明，在MnCl2催化下，150 ng/mLS.cerevisiaePDE1蛋白對3H-cAMP的底物轉(zhuǎn)化率能達到50%左右，而在300 ng/mLS.cerevisiaePDE1蛋白質(zhì)量濃度條件下，對3H-cGMP的底物轉(zhuǎn)化率能達到50.5%。此結(jié)果印證了關(guān)于S.cerevisiaePDE1蛋白是一種雙底物酶的結(jié)論，同時，也證明本實驗純化蛋白具有很高的生物活性。

圖7 MnCl2催化條件下S.cerevisiae PDE1蛋白對3H-cAMP（a）和3H-cGMP（b）的底物轉(zhuǎn)化率Fig.7 Substrate conversion efficiency of 3H-cAMP (a) and 3H-cGMP (b)by different concentrations of S.cerevisiae PDE1 under MnCl2 catalysis

3 討 論

由于在蛋白誘導表達的過程中，E.coli自身蛋白表達以及折疊機制缺乏等原因，將會產(chǎn)生大量的雜蛋白[26]。為了提高目的蛋白的產(chǎn)率，增加蛋白純度，本研究使用最優(yōu)的誘導條件，獲得大量的目的蛋白表達菌體。運用多種分離純化系統(tǒng)對表達蛋白進行純化，目的是制備具有高酶活性和高純度的重組S.cerevisiaePDE1蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)關(guān)于重組蛋白的純化僅利用重組蛋白的His-Tag進行Ni柱親和系統(tǒng)純化，如陳慧芹等[27]利用Ni柱純化羊口瘡病毒蛋白ORFV035，制造多克隆抗體；余璐璐等[28]利用Ni柱純化擬南芥氰丙氨酸合酶CYS-C1，并利用該純化蛋白制備多克隆抗體。通過對以往研究的總結(jié)，發(fā)現(xiàn)用作結(jié)構(gòu)生物學研究的蛋白一般會使用2 種以上的純化系統(tǒng)進行純化。如吳憂[29]利用Ni柱親和層析和分子篩對人源IDO1蛋白進行純化，得到95%以上純度的蛋白質(zhì)，并與小分子物質(zhì)進行共晶實驗研究；郭團玉等[30]利用陰離子交換柱與分子篩對酵母細胞中表達的絲氨酸蛋白酶進行純化，最后制備獲得無活性突變體晶體；張?zhí)m君等[31]通過Ni柱純化以及凝膠親和層析對人源Pelota C端結(jié)構(gòu)域進行充分純化，從而獲得該結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)。目前，有部分關(guān)于S.cerevisiaePDE1的功能及調(diào)控機制的研究，如蒲毅楠[32]對S.cerevisiaePDE1在細胞內(nèi)的定位與內(nèi)部調(diào)控機制進行了研究，認為PDE1趨向于集中到細胞生長最為茂盛的部位調(diào)節(jié)細胞生長和分化；馬琳等[15]對PDEs突變株S.cerevisiae發(fā)酵產(chǎn)生的果酒抗氧化性和揮發(fā)物質(zhì)差異性進行研究，PDEs突變株相比野生菌株具有更高的發(fā)酵速度，且Δpde2/Δpde2菌株具有更高的抗氧化能力。這些研究為S.cerevisiaePDE1在酵母細胞內(nèi)的分子調(diào)控起著重要的作用。而本研究所制備的大量高純度S.cerevisiaePDE1蛋白具有極高的生物活性，能夠大量水解cAMP，利用該純化蛋白開展下一步結(jié)構(gòu)生物學的研究，有望通過該研究為胞外調(diào)控S.cerevisiae細胞的生長代謝打下基礎(chǔ)。