IncI1和IncN質粒陽性沙門氏菌耐藥及質粒接合轉移特征

盛煥精，李怡讕，王澤維，牛沁雅，孟令緣，曹晨陽，李 偉，廉魯昕，楊保偉

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

沙門氏菌（Salmonella）是一種無芽孢、無莢膜的腸桿菌科革蘭氏陰性直桿菌，廣泛存在于人和動物腸道中，是全球范圍導致食源性疾病爆發的重要病原菌之一[1-3]。在美國等發達國家，沙門氏菌感染的年發病率高達15.4%[4]，由沙門氏菌引起的疾病爆發和住院治療均高于其他食源性細菌[5]。在中國，每年約3億人次因感染沙門氏菌而患病，達病原菌食源性疾病總數的70%～80%，給食品安全和消費者健康帶來嚴重危害[6-7]。

質粒是獨立于染色體外、可自主復制、通常攜帶多種抗性和毒力基因的閉合環狀雙鏈DNA，質粒的存在可使宿主菌產生耐藥性和致病性等附加特性[8]。其中，接合質粒是一種與耐藥基因水平傳遞和細菌耐藥性獲得的重要可移動元件[9]。在眾多質粒中，IncI1型質粒有助于blaCTX-M-1基因在禽類和人之間散播[10]，IncN型質粒已被歐洲多個國家的研究者報道攜帶blaCTX-M-1基因[11-12]。此外，研究還發現IncI1質粒有時還可與IncN質粒共同參與blaCTX-M-1耐藥基因的轉移，無論是IncI1還是IncN質粒，在分離自禽類糞便的大腸桿菌、分離自零售肉類和動物性產品的沙門氏菌中均有檢出[13-14]，且該2 種不相容型質粒往往被證明與某種特定耐藥基因的傳播密切相關。然而，我國關于此方面的研究還相對較少。

本研究以分離于我國部分省市的食源、人源和動物源沙門氏菌為材料，篩選攜帶IncI1和IncN質粒的菌株，闡明IncI1和IncN質粒在沙門氏菌中的流行狀況，質粒陽性菌株的藥敏性、與（氟）喹諾酮抗生素耐藥相關基因和超廣譜β-內酰胺酶（extended spectrumβ-lactamases，ESBLs）編碼基因的檢出情況以及該2 種質粒通過水平轉移傳播耐藥基因和耐藥性的水平，以期為保障微生物食品安全問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

表1 菌株信息Table 1 Information about the isolates used in this study

所用菌株為實驗室保存的分離于北京、上海、福建、河南、四川、廣東、廣西、陜西和新疆等地各類零售食品、臨床病人和食品性動物的沙門氏菌（n=956）以及香港理工大學惠贈的攜帶IncI1（n=12）和IncN（n=2）的人源性沙門氏菌[15-18]（表1）。藥敏性測定用標準質控菌株Escherichia coliATCC 25922和Enterococcus faecalisATCC 29212為中國藥品生物制品檢定研究院惠贈。

1.1.2 培養基

Luria-Bertani（LB）瓊脂、LB肉湯、Mueller Hinton瓊脂、麥康凱瓊脂 北京陸橋技術股份責任公司；XLT4培養基及其補充液 美國BD公司。

1.1.3 抗生素

藥敏性測定用抗生素：萘啶酮酸（nalidixic acid，NAL）、環丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、阿米卡星（amikacin，AMK）、硫酸慶大霉素（gentamicin，GEN）、鏈霉素（streptomycin，STR）、卡那霉素（kanamycin，KAN）、頭孢曲松（ceftriaxone，CRO）、頭孢西丁（cefoxitin，FOX）、頭孢噻呋（ceftiofur，TIO）、頭孢哌酮（cefoperazone，PER）、氨芐西林（ampicillin，AMP）、阿莫西林/克拉維酸（amoxicillin-clavulanic acid，AMC）、氯霉素（chloramphenicol，CHL）、四環素（tetracycline，TET）、復方新諾明（trimethoprim/sulfamethoxazole，SXT）和多黏菌素B（polymyxin B，PB）（均為分析純） 美國Sigma公司。

1.1.4 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物

ESBLs編碼基因（blaTEM、blaCTX-M、blaOXA、blaACC和blaPSE）和質粒介導的（氟）喹諾酮耐藥相關基因（qnrA、qnrB、qnrS、acc(6’)-Ib和qepA）擴增引物，IncN和IncI1不相容群質粒PCR復制子分型用引物均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成（表2）。

表2 PCR引物序列和產物大小Table 2 Primers sequences used for PCR amplification and size of corresponding PCR products

1.1.5 試劑

1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）、0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）、5×TBE緩沖液、瓊脂糖凝膠、dNTP、PCR buffer、MgCl2、rTaqTMDNA Polymerase、DL2000 DNA Marker 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設備

Mycycler PCR儀、DNA電泳和凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；Milli-Q純水儀 法國Millpore公司；磁力加熱攪拌器 美國Fisher公司；微波爐 廣州美的微波爐制造有限公司；-40 ℃低溫冰箱、-80 ℃低溫冰箱日本Sanyo公司；百分之一天平、萬分之一天平 德國賽多利斯公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安高壓儀器設備有限公司；隔水式恒溫培養箱 北京科偉實驗儀器有限公司；移液器、高速離心機 德國Eppendorf公司；生物安全柜 美國Labgard公司；超凈工作臺蘇州凈化設備有限公司；濁度儀 美國DADE Behring公司；數顯恒溫水浴鍋 北京科偉試驗儀器有限公司；恒溫搖床 上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 IncI1和IncN質粒分型

基于PCR復制子分型方法對質粒進行不相容群分析[19]，用單一PCR法篩選攜帶IncI1和IncN不相容群質粒的菌株。采用煮沸法制備DNA模板[20]。PCR條件：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性1 min，相應退火溫度條件下1 min、72 ℃延伸1 min，35 個循環；72 ℃延伸10 min。退火溫度由相應基因的引物序列決定。2 μL PCR產物經凝膠電泳和溴化乙錠染色后于凝膠成像系統下檢測。在低溫條件下將PCR粗產物送至上海桑尼生物科技有限公司測序，采用在線比對軟件BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進行比對，確定質粒類型。

1.3.2 藥敏性測定

采用美國國家臨床實驗室標準化委員會（Clinical and Laboratory Standards Institution，CLSI）[21]推薦使用的瓊脂稀釋法，測定供試抗生素對沙門氏菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentrations，MIC），參考CLSI的標準解讀藥敏性測定結果。

1.3.3 耐藥基因檢測

采用普通PCR檢測相關耐藥基因，引物如表2所示，PCR模板（菌株總DNA）、擴增體系和具體條件如1.3.1節所示。

1.3.4 質粒膜接合實驗

表3 接合用菌株信息Table 3 Information about the isolates used for conjugation

基于IncI1和IncN質粒陽性菌株及受體菌藥敏性結果，選擇分別攜帶IncI1質粒和IncN質粒的沙門氏菌作為供體菌，不含該2 種質粒的大腸桿菌和沙門氏菌為受體菌，采用膜過濾法進行接合，接合用菌株相關信息如表3所示。接合方法如下：取OD600nm為0.6的供體菌和受體菌菌液各1 mL于5 mL LB肉湯中混勻，轉入孔徑0.22 μm的濾器過濾，過濾后將濾膜緊貼于不含抗生素的LB瓊脂培養基表面，有菌的一面向上，37 ℃過夜培養。用5 mL LB肉湯清洗過夜培養的濾膜，梯度稀釋后分別涂布于同時含有CRO（32 μg/mL）和CIP（16 μg/mL）或同時含有STR（64 μg/mL）和CIP（16 μg/mL）的LB平板上，雙抗平板的選擇根據供體菌和受體菌的耐藥表型確定，每個梯度3 個平行，37 ℃培養48 h，計數。將OD600nm為0.6的受體菌梯度稀釋后均勻涂布于不含抗生素的LB平板，每個梯度3 個平行，37 ℃培養過夜，計數，用于菌液起始濃度的確定。同時，將供體菌和受體菌分別涂布于相應的雙抗平板上，每株菌3 個平行，37 ℃培養48 h，作為對照。培養結束后，確定供體菌和受體菌不能在相應的雙抗平板上生長時，再在涂布有不同稀釋度接合子的雙抗平板上隨機挑選10 個單菌落，以表2中的引物進行PCR擴增，擴增產物采用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳和測序分析，確定IncI1和IncN質粒在接合過程發生了水平轉移。接合子攜帶的耐藥基因和藥敏性檢測方法同1.3.1節和1.3.2節。接合頻率計算公式如下：

式中：T為陽性接合子平均菌落數；R為受體菌平均菌落數。

1.4 數據統計分析

利用Minitab?18.1對實驗數據進行處理，用χ2檢驗比較不同條件下的檢出率，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 IncI1和IncN質粒分型

表4 IncN和IncI1質粒陽性菌株篩選結果Table 4 Screening results of IncN and IncI1 plasmid positive isolates

956 株沙門氏菌中，IncI1質粒陽性菌的檢出率（n=42，4.39%）顯著（P＜0.05）高于IncN質粒陽性菌的檢出率（n=3，0.31%）。人源性沙門氏菌中共檢出27 株（27/404，6.68%）IncI1陽性菌，顯著（P＜0.05）高于食源性沙門氏菌中IncI1（15/552，2.72%）陽性菌檢出率。陜西食源沙門氏菌中IncI1質粒陽性菌的檢出率顯著（P＜0.05）高于其他省市（表4）。

2.2 藥敏性和耐藥基因檢測結果

基于不同采樣時間，采樣省份或同一省份不同采樣地點，分離沙門氏菌的食品類型，病人的年齡、性別、患病類型和醫院名稱，前期通過脈沖場凝膠電泳結合XbaI限制性內切酶對IncI1和IncN質粒陽性菌株分型的DNA帶譜類型結果，盡量選取來源和基因型不同的菌株作為進一步實驗的材料。本研究從45 株IncI1和IncN陽性沙門氏菌中挑選出26 株代表性菌株（包括香港理工大學惠贈的2 株IncN質粒陽性沙門氏菌）用于藥敏性和耐藥基因檢測。菌株對TIO（100.0%）耐藥率最高，其次為對NAL（92.3%）、AMP（92.3%）、CFP（88.5%）、TET（84.6%）、CRO（80.8%）、SXT（76.9%）、STR（76.9%）和CHL（61.5%）；對KAN（26.9%）、GEN（23.1%）、PB（23.1%）、CIP（19.2%）、AMC（15.4%）、FOX（11.5%）和AMK（3.8%）耐藥率較低（表4）。除TET（85.7%）外，攜帶IncI1型質粒的菌株對TIO（100.0%）、NAL（100.0%）、AMP（100.0%）、CFP（95.2%）和CRO（95.2%）的耐藥率顯著（P＜0.05）高于對其他10 種抗生素的耐藥率。IncI1質粒陽性菌株比IncN質粒陽性菌株的耐藥譜更寬，IncN型質粒陽性菌株均對PB、AMC、FOX和AMK敏感，對部分氨基糖苷類藥物，如STR和GEN的耐藥率較IncI1型質粒陽性菌株高（表5）。

表5 藥敏性檢測結果Table 5 Results of antimicrobial susceptibility test

26 株IncI1和IncN陽性菌對5 種常見的質粒介導的喹諾酮抗性相關耐藥基因和5 種ESBLs編碼基因的攜帶狀況檢測結果如表6所示。未在IncN和IncI1質粒陽性菌株中檢出qepA和blaACC，未在IncI1陽性菌中未檢出qnrA和qnrB，未在IncN陽性菌株中檢出blaCTX-M和blaPSE。IncI1質粒陽性菌株中，blaTEM和blaCTX-M基因的檢出率均顯著（P＜0.05）高于其他基因。

表6 IncI1和IncN質粒陽性沙門氏菌耐藥基因檢出情況Table 6 Prevalence of antibiotic resistance genes in IncI1 and IncN plasmids positive Salmonella

2.3 接合實驗

4 株IncI1型質粒陽性和2 株IncN型質粒陽性供體菌與受體菌T9-81（Salmonella typhimurium）發生接合的接合頻率在3.2×10-5～2.0×10—3之間，與大腸桿菌1-15的接合頻率在8.7×10—7～9.6×10—5之間（表7）。接合過程中，IncI1質粒與IncN質粒均能從供體菌轉移到受體，相對而言，IncI1質粒更容易通過接合作用轉移。

通過PCR對供體、受體和接合子攜帶的耐藥基因檢測結果表明，除blaTEM基因在供體菌I14對應的2 種接合子I14-S1和I24-S3中未檢出外，質粒攜帶的ESBLs編碼基因（blaTEM和blaCTX-M）和（氟）喹諾酮耐藥相關基因（qnrB和acc(6’)-Ib）在接合過程中均可從供體菌轉移至受體菌。接合后部分接合子獲得了供體菌質粒DNA編碼的相應抗性表型，如KAN、STR、GEN、CRO等。部分受體菌株接受IncI1和IncN質粒后對特定抗生素的耐藥表型與供體菌趨于一致。2 種不同類型的質粒發生轉移后，對應的接合子對SXT和TET的耐受性變化趨勢有所不同，表現出質粒的差異。從2大類接合子的藥敏性變化趨勢看，接合子對抗生素的耐受性變化與受體菌種屬差異關系不大，受體菌種屬的差異僅對接合頻率有所影響。

表7 供體菌、受體菌和接合子的藥敏性及耐藥基因檢測結果Table 7 Antimicrobial susceptibility profiles and antibiotic resistance genes of donors, recipients and transconjugants

3 討論與結論

耐藥沙門氏菌的廣泛存在已經成為世界性公共衛生問題[22]。質粒介導的細菌耐藥性不僅可以由親代垂直傳遞給子代，而且可以在不同微生物間水平傳播，成為養殖業、食品安全和人類健康的重大安全隱患[23-24]。基于PCR的復制子分型方法是研究質粒的不相容群和質粒傳播耐藥性的重要手段，目前，該方法已廣泛應用于在人源、食源和動物源致病性細菌間傳播耐藥性的質粒分類研究[25-26]。

國內外關于質粒不相容群、質粒不相容群和耐藥基因之間的關聯性研究越來越多。表明IncI1和IncN質粒在分離自禽類糞便的大腸桿菌、零售肉類和動物產品的沙門氏菌中十分普遍[13-14]，在中國流行的腸炎沙門氏菌具有頭孢菌素抗性主要是由于其攜帶多種blaCTX-M基因的IncI1質粒傳播[27]。IncN質粒在腸桿菌科細菌中也普遍存在，并被報道攜帶多種抗性決定簇，包括ESBLs和碳青霉烯酶等[28-29]。此外，攜帶不同種類耐藥基因的可接合性IncN質粒也在源于世界范圍內患者和環境樣品的不同細菌中被廣泛報道[30-32]。然而，該2 種不相容質粒大多集中在大腸桿菌和肺炎克雷伯菌中，關于沙門氏菌中IncN和IncI1質粒的流行狀況及其介導的耐藥性研究較少。

本研究對源自我國多個省市的人源性和食源性沙門氏菌進行IncI1和IncN不相容質粒陽性菌的篩查，但2 種質粒陽性菌的檢出率均低于現有報道的結果[19,31-32]。導致結果差異的原因一方面可能由于現有報道的供試菌株基本分離于零售食品和病死的食品性動物，另一方面，研究中供試篩選菌株的數量也會導致檢出率的差異。共篩查了956 株沙門氏菌，而現有研究的菌株數均較少。本研究還發現IncI1質粒在人源性沙門氏菌中的檢出率（6.68%）顯著（P＜0.05）高于食源性沙門氏菌（2.72%），陜西食源沙門氏菌中IncI1質粒陽性菌的檢出率顯著（P＜0.05）高于其他省市，這可能是由于其他省市菌株數量太少所導致。與此類似，其他研究在沙門氏菌和大腸桿菌中檢出IncN陽性菌株的比例為18.2%～25.6%，IncI1陽性菌株的比例為7.7%～31.8%[19,33-34]。盡管IncN和IncI1質粒陽性菌株的檢出率均不高，但由于該2 種質粒都是可接合性質粒，能通過細菌之間的接合作用介導耐藥性在不同環境中傳播[10-12]，導致細菌耐藥譜不斷增寬，耐藥性增強，因此需要引起相關部門足夠的重視。

質粒通常攜帶多種抗性基因和毒力基因，賦予宿主耐藥性和致病性等多種附加特性[8]。IncI1質粒攜帶β-內酰胺和IV型菌毛編碼基因，可賦予菌株免受抗生素和毒力入侵的能力，比普通菌株具有更強的致病性。來自于人源和動物源的細菌已在英國、巴基斯坦和洪都拉斯等國家被多次報道攜帶含有blaCTX-M-15基因的IncI1質粒[35-36]。本研究在人源和食品源IncI1質粒陽性菌株中主要檢出了blaTEM、blaCTX-M、acc(6’)-Ib、blaOXA和blaPSE基因。有研究表明，ESBLs常見型別編碼基因通常由質粒介導，可在同種或不同種屬的革蘭氏陰性菌間頻繁、廣泛地轉移[37]。方婷子[19]研究發現，沙門氏菌中IncI1質粒陽性菌（12.0%）均攜帶blaOXA-1；攜帶blaTEM-1基因的菌株攜帶IncHI2、IncP、IncI1和IncA/C等質粒。此外，本研究在IncN質粒陽性菌株中還檢出acc(6’)-Ib、qnrB、blaOXA、qnrA和qnrS等與頭孢菌素和（氟）喹諾酮類抗生素耐藥相關基因。據報道，IncN型質粒是臨床檢出菌株中的主要質粒類型，也是攜帶blaCTX-M、blaNDM和qnr等耐藥基因的主要質粒[38]，也是促進blaCTX-M基因水平傳播的常見流行質粒[11,39]，IncI1質粒有時還會與IncN質粒共同參與blaCTX-M-1耐藥基因的轉移[13-14]。qnr、acc(6’)-Ib和ESBLs編碼基因通常會位于同一質粒上，可通過接合、轉座作用轉移和傳播，因此攜帶該類質粒的沙門氏菌可以被認為是一個潛在的耐藥基因庫，如果此類沙門氏菌在社區或食品生產鏈中傳播，將會導致巨大的潛在危害[40]。本研究發現攜帶IncI1質粒的菌株比攜帶IncN質粒菌株的耐藥譜更寬，對頭孢類抗生素的耐受水平更高，而攜帶IncN質粒的菌株對氨基糖苷類抗生素的抗性則更高一些。由此可以推論，IncN質粒可能主要介導氨基糖苷類藥物耐藥，而IncI1型質粒主要介導頭孢類抗生素耐藥。當然，該2 類質粒介導的耐藥性是否和本研究的推斷結果一致，還需進行進一步研究。

通過耐藥質粒傳遞耐藥性是細菌中間最為常見也是最為重要的一種耐藥機制。本研究中，供體菌與沙門氏菌的接合頻率高于與大腸桿菌的接合頻率。IncI1和IncN質粒的接合轉移還賦予了受體菌對KAN、TIO、CRO、AMP、STR和GEN的耐藥表型，與以前研究結果相似[41-42]。

已有研究表明，IncI1型質粒是人源和食品源大腸桿菌及沙門氏菌攜帶和傳播β-內酰胺酶基因最常見的質粒之一，blaTEM、blaSHV、blaCTX-M、blaCMY和blaOXA基因通常會隨IncI1質粒的轉移而水平傳播[43-44]。blaTEM和blaCTX-M可通過IncN和IncI1在禽類和人之間廣泛傳播[10,41]，IncN質粒也被歐洲多個國家的研究者報道攜帶有blaCTX-M-1[11-12]。本研究中，blaCTX-M-55和blaCTX-M-3均被證明可隨IncI1和IncN型質粒在接合過程從供體菌傳遞給受體菌。雖然blaTEM在大部分供體和接合子中均有檢出，但在I14作為供體菌時均未在接合子中檢出，表明IncI1質粒可能在轉移過程沒有將宿主細胞中的質粒完整地轉移到受體菌，也可能在接合過程中部分基因丟失。當然，導致未能發生轉移的具體原因尚待進一步通過S1-PFGE結合Southern-blot和質粒序列分析證明。除ESBLs編碼基因外，qnr和acc(6’)-Ib-cr也通常位于接合質粒上，并且可以通過接合作用進行轉移和傳播[46]，本研究在IncN質粒陽性菌株中檢出的qnrB和acc(6’)-Ib基因均可通過接合傳給受體菌。

研究IncI1和IncN質粒在沙門氏菌中的流行狀況及其在不同種屬細菌間的傳播其轉移規律，將有助于對細菌耐藥性傳播提供實驗依據，對食源性疾病爆發的原因進行溯源和風險評估，降低或防止食品安全事件的發生提供依據。