1 株分離自宋河鎮濃香型白酒酒醅的產香細菌鑒定及風味物質分析

劉冰冰，周開心，葉麗靖，余盈盈，李學思，閆培勛，郭書賢,

（1.南陽理工學院 河南省工業微生物資源與發酵技術重點實驗室，河南 南陽 473004；2.河南省宋河酒業股份有限公司，河南 鹿邑 477265）

濃香型白酒的發酵是酒曲、窖泥及酒醅之間微生物以酒醅為載體發生復雜生化反應的過程，這一期間不同微生物之間相互作用，菌群結構發生有序變化[1]。濃香型白酒的香味物質主要來自酒醅中微生物發酵，其中丁酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯是濃香型白酒中微生物發酵產生的主要香味物質，另外還包括其他醇酸類等[2]。

一般把能夠產生香味或能夠產生產香物質前體的微生物統稱為產香菌。產香菌包括香氣及其前體物產生菌[3-6]（如己酸菌、醋酸菌、乳酸菌、丙酸菌、丁酸菌、芽孢桿菌、硫酸鹽還原菌、硝酸鹽還原菌、鏈霉菌等）及酯化酶產生菌（如釀酒酵母菌、漢遜酵母菌、假絲酵母屬、酒香酵母屬、球似酵母菌屬等[7-8]；曲霉、根霉等[9]）。對產香微生物進行分離及鑒定，有助于進一步研究白酒發酵過程中微生物的功能，同時也能夠進一步指導實踐生產。利用產香微生物制作成己酸菌液、酯化酵母液、生香窖泥等效果顯著[10-12]。決定濃香型白酒品質的主要風味物質是己酸乙酯，通過對產香微生物的研究，提出“增己降乳”的指導思路，對于提升白酒品質及競爭力具有重要的理論價值[13-14]。酒醅是白酒的主要產生體，對于宋河鎮濃香型白酒，酒醅的發酵時間歷經60 d。宋河鎮濃香型白酒豐滿醇厚的口感與酒醅中微生物有重要的關系。本研究以宋河鎮濃香型白酒不同時期酒醅作為研究對象，探尋其中的產香微生物類群，研究產香微生物的生理生化特性，以期為進一步挖掘與利用宋河鎮濃香型白酒酒醅產香微生物的代謝特征提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

表1 酒醅樣品信息Table 1 Information about samples of fermented grains tested in this study

2018年3 月于河南省鹿邑縣宋河鎮宋河酒業股份有限公司濃香型酒窖中取酒醅樣本。按照酒醅發酵周期，取發酵0 d窖池中間酒醅樣品，發酵3、15、27、48、60 d窖池中間酒醅及貼壁酒醅上、中、下3 個位置的樣品；窖池中間、窖池壁的上中下位置樣品分別混合，總計合并為11 個樣品，裝于無菌采樣瓶中，4 ℃保藏。樣品信息如表1所示。

1.1.2 培養基種類與組成

1.1.2.1 菌株分離培養基

高氏培養基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO40.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH值自然，121 ℃滅菌20 min。待培養基冷卻至60 ℃左右，添加制霉菌素（50 μg/L）以抑制真菌的生長。

1.1.2.2 菌株形態鑒定培養基

R2A培養基：酵母浸出粉0.5 g，蛋白胨0.5 g，酪蛋白水解物0.5 g，葡萄糖0.5 g，可溶性淀0.5 g，K2HPO40.3 g，MgSO4·7H2O 0.024 g，丙酮酸鈉0.3 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

CDA培養基：K2HPO41 g，KCl 0.5 g，NaNO32 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

ISP4培養基：可溶淀粉性10 g，K2HPO42 g，CaCO34 g，微量鹽2 mL，(NH4)2SO44 g，MgSO4·7H2O 2 g，NaCl 2 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

ISP3培養基：燕麥片20 g＋1 L水煮沸20 min，粗紗布過濾補水到1 L，微量鹽1 mL，瓊脂20 g，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

ISP5培養基：L-天門冬酰胺1 g，甘油10 g，K2HPO41 g，微量鹽1 mL，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

ISP2培養基：酵母膏4 g，麥芽膏10 g，葡萄糖4 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

微量鹽培養基：FeSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·H2O 0.1 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，蒸餾水100 mL，pH值自然。

選用標準為菌株最適生長培養基及放線菌形態特征描述國際公認培養基。

1.1.2.3 生理生化檢測及酶活性篩選培養基

溫度生長范圍、抗生素敏感、乙醇耐受實驗的培養基選自1.1.2.2節最適生長培養基。

碳源利用基礎培養基：(NH4)2SO42.64 g，KH2PO42.38 g，K2HPO45.65 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，微量鹽1 mL，蛋白胨0.125 g，胰蛋白胨0.25 g，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4。

酶活性檢測基礎培養基：K2HPO40.5 g，葡萄糖0.5 g，KCl 0.5 g，硝酸鉀1 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 L，pH值自然。

淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、酯分解酶活性檢測培養基分別以酶活性檢測基礎培養基為母液，分別添加0.5%的可溶性淀粉、羥甲基纖維素鈉（0.2%）、果膠、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80，pH 7.2。

酯化酶檢測培養基[15]：聚乙烯醇乳化液100 mL，酶活性檢測基礎培養基1 000 mL，pH值自然。聚乙烯醇乳化液：30 mL 3%聚乙烯醇，10 mL甘油三丁酸酯，放于冰箱5～10 ℃靜置1～2 h，超聲波破碎儀120 W處理60 min，溶液由分層變成均勻乳白色，且不再分層。乳化液經過濾器過濾除菌，按照每100 mL培養基加入1 mL乳化液倒平板（聚乙烯醇乳化液現用現配）。

1.2 儀器與設備

LD2X-50KBS立式高溫滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；FA1004電子天平 上海恒平科學儀器有限公司；SWCJ-ZG單人凈化工作臺 蘇中凈化公司；BPS-150生化培養箱 上海訊博實驗儀器公司；HZQ-B數顯恒溫搖床蘇威爾試驗儀器公司；AX10相差顯微鏡 德國蔡司公司；Centrifuge 5430R高速冷凍離心機 德國默克公司；SB-800DT超聲波清洗儀 寧波新芝生物科技有限公司；SMART-N水純化系統 立康生物醫療控股有限公司；HYC-390醫用冷藏冰箱 海爾醫療電器有限公司；7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株純培養分離及純化

將酒醅樣品無菌條件下自然風干，采用梯度稀釋方法稀釋濃度為10-3。取100 μL菌懸液涂布于分離平板上，放入37 ℃培養箱中培養3～5 d，觀察菌種生長情況及形態。挑取不同形態微生物于R2A培養基上轉接2 代，37 ℃培養3 d以獲得形態單一的純菌株。超凈工作臺中，打開培養皿蓋一端，通過30 名學生的感官評判，判斷菌株是否產生香味。對產香菌株進行轉接擴繁，保藏甘油管。

1.3.2 菌株形態觀察

接種菌株于R2A、CDA、ISP4、ISP5、ISP3、ISP2的斜面中，37 ℃培養3～4 d，觀察菌株的菌體顏色、形態、產孢及產色素情況[16]。接種菌株于R2A液體培養基中，37 ℃搖床培養3～4 d，4 000 r/min離心收集菌體，用生理鹽水沖洗菌體2～3 次，以洗去培養基成分，最終制成生理鹽水菌懸液，于40 倍光學顯微鏡下觀察菌株形態特征。革蘭氏反應檢測選用KOH方法[17]。

1.3.3 菌株16S rRNA基因克隆鑒定及系統進化分析

采用Power soil試劑盒提取產香菌株基因組，選用16S rRNA基因引物[18]（27F：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。擴增體系為：2×TaqPCR StarMix（康潤生物）10 μL，引物各1 μL，模板DNA 1 μL，去離子水7 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環32 次；72 ℃延伸10 min。送生工生物工程（上海）股份有限公司進行16S rRNA基因克隆測序。16S rRNA基因序列通過EZBioCloud[19]進行比對，分析菌株16S rRNA基因相似性，初步確定菌株分類地位。下載相似菌株16S rRNA基因序列，選用CLUSTAL-X軟件[20]進行多重序列比對，采用MEGA 5[21]構建菌株16S rRNA基因NJ系統進化樹[22]。

1.3.4 生理生化指標鑒定

1.3.4.1 不同溫度生長實驗

將菌株接種于R2A固體培養基上，分別置于25、30、37、42、45、50 ℃恒溫箱中培養2～3 d，觀察其生長情況，界定菌株的溫度生長范圍及最適生長溫度。實驗設置3 個重復。

1.3.4.2 抗生素敏感實驗

采用0.85%生理鹽水制作菌株菌懸液，涂布于R2A固體培養基上。采用紙片法[23]，選用制菌霉素（100 μg/片）、多黏菌素（300 IU/片）、慶大霉素（10 μg/片）、利福平（5 μg/片）、新生霉素（30 μg/片）、桿菌肽（0.04 U/片）、新霉素 （30 μg/片）、紅霉素（15 μg/片）、氯霉素（30 μg/片）、氨芐西林（10 μg/片）、諾氟沙星（10 μg/片）、卡那霉素（30 μg/片）、萬古霉素（30 μg/片）、四環霉素（30 μg/片）等抗生素紙片點植于涂布菌體的R2A固體培養基上，37 ℃培養3 d，觀察菌株對抗生素的耐受特征。實驗設置3 個重復，取2 個及以上一致的結果記錄為陽性實驗數據。

1.3.4.3 酶活性檢測

采用點植法，分別接種菌株于淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、酯化酶活性檢測平板中，37 ℃培養3～4 d，觀察菌落周邊透明圈有無及大小，判斷產蛋白酶、酯化酶特性；采用碘液染色，觀察菌株周邊透明圈有無及大小判斷產淀粉酶特性；采用0.2%的剛果紅染色30 min，隨后用2%的NaCl溶液浸泡沖洗至洗脫液為無色，觀察菌株周邊透明圈有無及大小，判斷產纖維素酶特性。實驗設置3 個重復，取2 個及以上一致的結果記錄為陽性實驗數據。

1.3.4.4 不同pH值條件下酶活性檢測實驗

1.3.4.5 API試劑條檢測

分別選用API ZYM[26]、API 50CH、API 20NE試劑條（bioMérieux）對菌株的酶學特性、碳源產酸、碳源利用等生理生化特性進行檢測。恒溫箱37 ℃培養，按照API操作手冊進行結果觀察并記錄。

1.3.4.6 乙醇耐受檢測

在酒醅發酵過程中微生物會持續產生乙醇，一定體積分數的乙醇會對微生物生長產生不同程度的抑制作用。本實驗分離到的菌株分離自酒醅中，且在酒醅發酵前期3 d及發酵中期27 d均分離得到，說明該菌株能夠耐受一定量的乙醇。配制不同乙醇體積分數（0%、2%、5%、8%、10%、12%、15%、18%、20%）的R2A液體培養基于帶有內塞的5 mL螺口厭氧瓶中，115 ℃滅菌20 min，加入200 μL菌懸液（OD600nm≈1.0），37 ℃、140 r/min倒置搖床培養4～6 d，測定OD600nm值判斷乙醇耐受范圍。實驗設置3 個重復，取3 個平均值記錄為實驗數據。

1.3.5 有氧及無氧條件下菌株G培養基發酵液揮發性物質檢測及分析

采用頂空-氣相色譜-質譜聯用法[27]檢測發酵液中的揮發性物質成分。取發酵液6 mL裝入20 mL頂空瓶中密封好，45 ℃條件下對樣品瓶振蕩加熱45 min，在100 ℃條件下對儀器閥和定量環進行加熱，傳輸線溫度設定110 ℃。樣品進樣體積1 mL，進樣時間1 min。氣相色譜-質譜分析儀進樣口溫度240 ℃，載氣為氦氣，流速1.2 mL/min，分流比5∶1。柱箱升溫程序：初始溫度50 ℃，維持2 min；以3 ℃/min速率升溫至80 ℃，維持2 min；以3 ℃/min速率升溫至230 ℃，維持10 min。質譜條件：使用電子電離源，設定離子源溫度230 ℃，四極桿溫度170 ℃，輔助加熱溫度250 ℃；電子能量70 eV，燈絲流量0.20 mA，檢測器電壓350 V。采用全掃模式收集信號，掃描范圍m/z33～550。測定結果經計算機檢索譜庫NIST14.L進行定性分析，面積歸一化法進行定量分析，通過匹配度及CAS號判斷可能的物質種類。

2 結果與分析

2.1 菌株分離情況

純化得到1 株放線菌形態的微生物，R2A固體培養基上呈黃色、不產孢、質地堅硬、有基絲、表面有少許黏液狀分泌物，嗅覺感官評判具有一定香味，記錄菌號為12。對比不同培養基的形態特征，分析純培養結果可知，在酒醅發酵3、15、27 d的樣點中均分離到該菌株，且靠近酒池壁樣品P3-B分離較多，共得到6 株；15 d酒池中間樣品P15-Z分離到2 株；27 d酒池中間樣品P27-Z分離到1 株。在0、48、60 d酒醅樣品中均未分離得到。

老巴說：“我曉得。剛才四強來借輪椅，我叫他晚上來拿。擱在墻角，蠻久沒有用，灰大。你拿出來，抹一抹給他。”

2.2 菌株形態

2.2.1 12 號菌株在不同培養基斜面的生長情況

如表2所示，在CDA、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、R2A上均有不同程度的生長，以R2A培養基生長最優，菌體為黃色，有基內菌絲，不分泌色素，無氣生菌絲。

表2 12號菌株斜面生長情況Table 2 Growth conditions of strain 12

2.2.2 12 號菌株平板及光學顯微鏡形態特征

12號菌株為革蘭氏陽性菌株，在R2A固體培養基上生長3 d的平板及光學顯微鏡形態如圖1、2所示。菌落為黃色，無孢子，表面有分泌物，有基絲，難以挑取。40 倍光學顯微鏡顯示，菌株呈不規則球狀，且分泌有大量顆粒狀胞外物質。

圖1 12號菌株的平板菌落形態Fig.1 Plate colony morphology of strain 12

圖2 12號菌株的相差顯微鏡形態Fig.2 Phase contrast microscope image of the morphology of strain 12

2.3 12號菌株16S rRNA基因分子鑒定及系統發育分析

16S rRNA基因比對結果表明：12號菌株與Cellulosimicrobium cellulans最為相似，相似度為99.72%，其次為C.aquatile（99.65%）、C.funkei（99.65%）、C.marinum（98.89%），初步判斷12號菌株的分類地位為：細菌（Bacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、放線菌綱（Actinobacteria）、微球菌目（Micrococcales）、原小單孢菌科（Promicromonosporaceae）、纖維微菌屬（Cellulosimicrobium）。

圖3 12號菌株16S rRNA基因序列系統進化NJ樹Fig.3 Neighbor-Joining phylogenetic tree based on nearly complete 16S rRNA gene sequence of strain 12

如圖3所示，12號菌株與C.cellulans、C.aquatile共聚在一個分支上，說明在進化關系上與這兩株菌較相近；3 株菌的共同分支與C.marinum、C.funkei分別位于不同的分支，5 株菌共同組成一個大的分支，綜合16S rRNA基因序列比對結果，判斷12號菌屬于纖維微菌屬（Cellulosimicrobium）。Schumann等[28]首次描述了纖維微菌屬，目前為止，該屬包括5 個生效發表種[29]：C.cellulans（2001）[28]、C.funkei（2006）[30]、C.terreum（2007）[31]、C.marinum（2016）[32]、C.aquatile（2015）[33]。該屬的一個重要特征是具有纖維素分解活性。目前報道已經從臨床樣本[30]、土壤[31]、海底沉積物[32]、水庫[33]、海洋海綿[34]、南極洲冰雪[35]等環境中分離到該類群。本次實驗首次從宋河鎮濃香型白酒酒醅中分離到纖維微菌屬的菌株。

2.4 生理生化實驗

2.4.1 溫度耐受實驗

表3 12號菌株的溫度生長情況Table 3 Growth of strain 12 at different temperatures

如表3所示，12號菌株的生長范圍為15～50 ℃，最適生長溫度為30～37 ℃。在20、25 ℃條件下生長較30 ℃與37 ℃時慢，感官判斷香味較淡；在30～37 ℃生長趨勢最好，感官判斷香味較濃；42 ℃時生長開始減弱，45 ℃時生長受到高溫抑制，50 ℃幾乎不長。

2.4.2 抗生素實驗

圖4顯示，卡那霉素、四環素、新生霉素、萬古霉素、利福平、多黏菌素、氯霉素、慶大霉素、新霉素、紅霉素這10 種抗生素對菌株具有明顯抑制作用；諾氟沙星、氨芐西林、制霉菌素、桿菌肽這4 種抗生素對菌株沒有抑制作用。

圖4 12號菌株的抗生素實驗Fig.4 Inhibitory effect of antibiotics on strain12

2.4.3 菌株酶活性特征

12號菌株在pH 7.0固體培養條件下，蛋白酶、氧化酶、過氧化氫酶為陽性；淀粉酶、纖維素酶、酯化酶均為陰性。不同的培養條件有可能會導致菌株的酶活性質發生變化，結合菌株的分離環境，選用液體條件下，以羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、濾紙、淀粉、脫脂牛奶、三丁酸甘油酯，在不同的pH值條件下，測定其生長情況及相關酶活性性質。

圖5 12號菌株不同底物、不同pH值液體條件下生長情況Fig.5 Growth conditions of strain 12 in liquid medium with different substrates and at different pH values

如圖5所示，以羧甲基纖維素鈉為底物，4 d之后在pH 5.5～7.0范圍內有明顯生長現象；以微晶纖維素為底物，4 d之后在pH 5.5～7.0范圍內有明顯生長現象；以濾紙為底物，4 d之后在pH 5.5～7.0范圍內有明顯生長現象。采用3,5-二硝基水楊酸法測定還原糖結果表明，在以羧甲基纖維素鈉為底物條件下，pH 5.5～6.0范圍內還原糖檢測反應為陽性；在以微晶纖維素為底物條件下，pH 5.0～6.5范圍內還原糖檢測反應為陽性；在以濾紙為底物條件下，pH 5.5～6.0范圍內還原糖檢測反應為陽性；3 種底物條件下能夠在液體酸性條件下檢測到菌株具有纖維素酶活性。菌株在以淀粉為底物的培養基中，1 d之后即有明顯生長現象，pH 5.0～8.0之間均具有明顯生長趨勢，且各自表現出不同顏色，說明不同pH值條件下菌株以淀粉為底物發酵產物可能具有一定差異。牛津杯法檢測發現pH 5.0～7.5的發酵液有淀粉酶活性。菌株在以脫脂牛奶為底物的培養基中，2 d能明顯觀察到生長現象，pH 5.0～10.0生長明顯，牛津杯法檢測發現pH 5.5～9.5的發酵液有蛋白酶活性。菌株在以三丁酸甘油酯為底物的培養基中，幾乎觀察不到生長現象，發酵7 d之后，牛津杯法檢測不同pH值發酵液無酯酶活性。結合后續菌株API ZYM實驗中，類脂酶（C14）活性為陰性，酯酶（C4）及類脂酯酶（C8）活性為陽性，有可能該菌株只能合成或分解較短的脂肪酸鏈，不能合成或分解較長的脂肪酸鏈。

2.4.4 12 號菌株API系統鑒定

2.4.4.1 12號菌株API 20NE檢測結果

API 20NE結果表明，12號菌的硝酸鹽還原、葡萄糖酸化、精氨酸雙水解酶、脲酶、葡萄糖苷酶、明膠蛋白酶、半乳糖苷酶反應為陽性，色氨酸水解呈陰性，吲哚產生實驗為陰性。碳水化合物同化實驗中對硝基-D-甲基半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、N-乙酰-葡萄糖胺、麥芽糖、葡萄糖鹽酸同化實驗為陽性，甘露醇、葵酸、己二酸、檸檬酸、苯乙酸同化實驗為陰性。

2.4.4.2 12號菌株API 50CH檢測結果

API 50CH結果顯示，12號菌株能利用甘油、L-阿拉伯糖、D-木糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、N-乙酰-葡糖胺、七葉靈、纖維二糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、淀粉、肝糖、龍膽二糖、D-松二糖、D-米蘇糖作為碳源生長且產酸。不能利用以下碳源產酸：赤蘚醇、D-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、L-木糖、阿東醇、β-甲基-D-木糖苷、山梨糖、鼠李糖、衛茅醇、肌醇、甘露醇、山梨醇、α-甲基-D-甘露糖苷、α-甲基-D-葡萄糖苷、苦杏仁苷、熊果苷、柳醇、乳糖、蜜二糖、菊糖、松叁糖、棉子糖、木糖醇、D-塔格糖、D-巖糖、L-巖糖、D-阿拉伯糖醇、L-阿拉伯糖醇、葡萄糖酸鹽、2-酮基-葡萄糖酸鹽、5-酮基-葡萄糖酸鹽。結合菌株特殊的分離生境，菌株的產酸特性在酒醅發酵過程中可能具有重要的作用。具體產生何種酸及相關副產物有待于進一步分析。

2.4.4.3 12號菌株API ZYM檢測結果

API ZYM結果顯示，12號菌株的堿性磷酸鹽酶、酯酶（C4）、類脂酯酶（C8）、白氨酸芳胺酶、纈氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、β-半乳糖苷酶、β-糖醛酸苷酶、葡萄糖苷酶、N-乙酰-葡萄糖苷酶反應為陽性。類脂酶（C14）、α-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-巖藻糖苷酶反應為陰性。

2.4.5 12 號菌株乙醇耐受實驗

表4 12號菌株乙醇耐受實驗OD600 nm值Table 4 OD600 nm values from tolerance of strain 12 to ethanol at different concentrations

選用剛加入菌液未發酵作為對照，測定其OD600nm為0.046。分析可知12號菌在0%～9%的乙醇體積分數下均具有一定的生長現象，但是隨乙醇體積分數的進一步增加，菌株生長受到一定抑制（表4）。說明較高濃度的乙醇對菌株具有抑制作用，這也能夠說明為何在48、60 d酒醅樣品中并未分離到該菌株，而在3、15、27 d的酒醅樣品中能夠分離到該菌株。

2.5 菌株發酵液揮發性物質分析

表5 12號菌株在有氧條件下揮發性物質檢測結果Table 5 Analysis of volatile substances produced by strain 12 under anaerobic conditions

表6 12號菌株在厭氧（低氧）條件下揮發性物質檢測結果Table 6 Analysis of volatile substances produced by strain 12 under aerobic conditions

白酒發酵過程既包含有氧也包含低氧條件，結合菌株在高氏培養基上能夠聞到香味的特性，選用G培養基模擬在有氧及低氧條件下進行發酵，檢測其中的揮發性物質。表5、6表明，在有氧條件下，淀粉為底物發酵液中檢測到甲硫醇（匹配度58）、酸草醯脲（匹配度42）、2,2,4-三甲基-3-羧基異丁基戊酸酯（匹配度46），由于匹配度都較低，且對應結果的峰值過低，有可能是在發酵過程中大部分的揮發性物質已經散發，所以檢測不到相關的風味物質。采用厭氧瓶密封發酵2 d，以淀粉為底物，檢測到發酵液中可能含有乙醇（匹配度64）、醋酸（匹配度90）、1,2,2-三氯-1,1-二氟乙烷（匹配度47）、2-十五烷基丁酸酯（匹配度30）。相比較而言，菌株在低氧條件下主要是產酸及產乙醇，另外也有少量復雜化合物產生，在有氧條件下會更多地生成更為復雜的化合物，但是由于含量少或者是數據庫未匹配到，所以目前未知其確切成分，有待于進一步分析。

3 結 論

12號菌株是分離自宋河鎮濃香型白酒酒醅中的1 株產香放線菌，在酒醅發酵3、15、27 d的樣點中均能分離得到，且在3 d樣點中分離到的數目較多。12號菌株判斷為纖維纖維微菌的一個菌株，首次在酒醅樣品中分離得到，在R2A斜面培養基上生長最適合，其次是ISP3和ISP4。最佳生長溫度為30～37 ℃，生長溫度范圍為15～50 ℃，乙醇耐受范圍為0%～9%。菌株對諾氟沙星、氨芐西林、制霉菌素、桿菌肽不敏感，對卡那霉素、四環素、新生霉素、萬古霉素、利福平、多黏菌素、氯霉素、慶大霉素、新霉素、紅霉素等抗生素敏感。菌株在酸性或中性偏酸性液體條件下生長情況較好。菌株在液體條件下具有纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶活性，在酸性條件下能夠檢測到以羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、濾紙為底物纖維素酶活性；淀粉酶的活性主要是酸性條件下能夠檢測得到；蛋白酶的活性在酸性、中性及堿性條件下都能夠檢測得到；以三丁酸甘油酯為底物的酯酶活性在固體及液體條件下（pH 4.0～10.0）均未檢測到。

微生物代謝參與了白酒發酵過程中復雜風味物質的形成，尤其是產香微生物，能夠代謝產生香味物質或是香味物質的前體物質。本實驗從宋河鎮濃香型白酒酒醅樣品中分離到12號菌株，通過感官評判，發現菌株能夠產生一定的香味，通過進一步對菌株好氧及厭氧（低氧）條件下的揮發性物質進行檢測，發現菌株在低氧條件下能夠產生乙酸乙酯的前體物質乙醇、乙酸。結合API ZYM酶活性檢測結果顯示，菌株具有酯酶（C4）、類脂酯酶（C8）活性，無類脂酶（C14）活性；同時在以三丁酸甘油酯（C15）為底物的固體及液體條件下均未檢測到酯酶活性，從而判斷菌株可能合成或分解較短碳鏈的脂肪酸鏈，不能合成或分解較長的脂肪酸鏈。在后續的研究中，可以選擇不同的碳源，添加適量氮源及延長發酵時間檢測菌株的揮發性物質。同時可以對該菌株進行特定引物設計，利用免培養的手段從宋河鎮濃香型白酒窖泥、酒醅、酒曲、環境等取樣測定，探究菌株的來源。