傳統發酵東北酸菜中植物乳桿菌HUCM115的分離及益生特性

國立東，張文文，劉 艷，黃夢玲，門 悅，張燕麗，王麗群

（1.黑龍江中醫藥大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學實驗實訓中心，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江省農業科學院食品加工研究所，黑龍江 哈爾濱 150086）

傳統發酵食品往往因獨特的風味、口感甚至特有的營養價值而在人類食品中占有重要地位，既包括奶酪、酸奶、開菲爾以及發酵香腸等動物性發酵食品，也包括酸菜、泡菜等植物性發酵食品。東北酸菜是我國東北地區人們以貯藏秋菜而在漫長冬季仍能攝取蔬菜為目的的產物之一，并已成為東北地區重要的一種特色傳統發酵食品，可生熟兩吃。傳統東北酸菜主要以白菜為原料進行自然發酵，以口感酸爽、脆嫩，風味獨特，富含多種氨基酸等特點于一身而聞名[1]，這與酸菜在自然發酵制備過程中微生物的組成及作用息息相關。酸菜的菌相組成主要源于附著在蔬菜表面的天然本土微生物，其與地域環境有關，因此東北地區的氣候及環境條件賦予了東北酸菜特有的風味及營養價值。傳統發酵酸菜的微生物菌群涵蓋了細菌和真菌兩大類，且以細菌占絕對優勢，而細菌中又以乳酸菌為優勢菌，主要包括乳桿菌屬、明串珠菌屬等。乳酸菌作為益生菌的重要來源而備受關注，并成為研究熱點。大量動物及人體臨床研究表明，乳酸菌具有諸多明確的益生功能，如可降膽固醇[2]、抗糖尿病[3]、抗肥胖[4]、抗抑郁[5]、抗氧化[6]、可降解草酸鹽防治腎臟疾病[7]等，這些益生特性具有菌種和菌株特異性[8]。因此，從傳統自然發酵酸菜中分離篩選性狀優良的具有潛在應用價值的乳酸菌具有重要意義。本研究從東北酸菜中分離篩選到1 株乳酸菌，通過形態學及基因序列比對分析對其種屬進行鑒定，并探究其益生特性，旨在為益生菌產品的開發及工業潛在發酵劑菌種篩選提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

酸菜來源于黑龍江哈爾濱地區家庭，均采用傳統自然發酵制作。

1.1.2 培養基

改良MRS（mMRS）培養基，參照文獻[9]的方法配制。胰蛋白胨酵母膏葡萄糖（tryptone yeast glucose，TYG）液體培養基，參照文獻[10]方法配制。

1.1.3 試劑

膽固醇 美國Amresco公司；牛膽粉 德國Merck公司；γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）美國Sigma公司；L-谷氨酸 國藥集團化學試劑有限公司；細菌基因組提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；三乙胺、正己烷、乙腈均為色譜純；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

1260 高效液相色譜儀 安捷倫（中國）科技有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；DM2500顯微鏡 上海徠卡顯微鏡有限公司；SPX-200-II生化培養箱 上海躍進醫療器械廠；BXM-30R全自動高壓滅菌鍋 上海博訊實業有限公司；TGL-16離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

使用無菌鑷子及勺取酸菜及汁液樣品于無菌離心管中，并放入冰盒立即帶回實驗室于4 ℃冰箱短暫保存，待分離乳酸菌。

1.3.2 乳酸菌的分離

當天采集的酸菜樣品用無菌生理鹽水重懸，適當梯度稀釋后涂布于含0.75% CaCO3的mMRS固體培養基上，37 ℃培養48 h，挑取周圍形成透明圈的菌落進行純化，革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的菌株初步確定為疑似乳酸菌。

1.3.3 菌株的鑒定

記錄疑似乳酸菌分離株的菌落及菌體細胞特征，參照文獻[9]的方法進行16S rDNA基因的擴增、測序，并通過MEGA5.1軟件與乳桿菌屬內模式菌株的16S rDNA基因序列進行比對分析，構建系統發育樹，并結合pheS基因序列構建的系統發育樹進行種間與種內的鑒定，pheS基因擴增引物及聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）條件參照文獻[11]。

1.3.4 酸與膽汁耐受性測定

通過pH 2.0、2.5和pH 3.0酸性環境，或0.3 g/100 mL和0.5 g/100 mL牛膽汁脅迫環境下菌株的存活情況分別評價菌株的酸和膽汁耐受性。傳代3 次活化的菌株經發酵培養后離心獲取菌泥，分別用與發酵液等體積不同脅迫環境條件的mMRS液體培養基繼續培養3 h，用平板菌落計數法分別檢測0、1、2、3 h的活菌數，從而確定其對酸或膽汁的耐受能力。

1.3.5 自動聚集能力測定

菌株自動聚集能力評價參照文獻[12]方法，以自動聚集百分比表示。菌株在mMRS液體培養基中培養24 h后，培養物旋渦振蕩2 min，取1 mL檢測細菌懸浮液在600 nm波長處的吸光度（A0），隨后室溫靜置，分別于振蕩后30、60、90、120、150 min取1 mL上層清液測定600 nm波長處吸光度，記為At。不同時間點菌株自動聚集百分比計算如式（1）所示：

1.3.6 體外降膽固醇特性的檢測

菌株經mMRS液體培養基活化后，按1%接種至含0.3 g/100 mL牛膽汁和100 μg/mL膽固醇的mMRS液體培養基中，37 ℃培養24 h后離心獲取上清液，采用鄰苯二甲醛法[13]分別檢測接種前后培養基中膽固醇含量，并按式（2）計算菌株的膽固醇去除率[14]：

式中：C0為未接種乳酸菌培養上清液膽固醇質量濃度；C1為接種乳酸菌培養上清液膽固醇質量濃度。

1.3.7 發酵液中GABA的測定

菌株在mMRS液體培養基中傳代3 次活化后，按1%接種至含1%谷氨酸的TYG液體培養基中，37 ℃培養48 h，發酵液上清液經0.22 μm濾膜過濾后供GABA檢測分析。GABA檢測采用異硫氰酸苯酯柱前衍生反相高效液相色譜法，衍生化處理及色譜條件參照文獻[15]。

1.4 數據分析

數據采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，應用單因素方差分析進行組間比較，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離與鑒定

2.1.1 菌株的分離

采集的傳統自然發酵酸菜樣品經mMRS選擇性培養基分離篩選，共分離到可在含0.75% CaCO3的mMRS固體培養基上形成透明圈菌落、革蘭氏陽性且過氧化氫酶陰性的疑似乳酸菌9 株，分離結果如圖1所示。生長速度是篩選工業發酵劑菌種的重要指標之一，故選取了其中1 株在液體培養基中生長速度最快的菌株HUCM115進行深入研究。

圖1 酸菜樣品中乳酸菌的分離Fig.1 Flow chart of isolation of lactic acid bacteria from traditional pickled Chinese cabbage

2.1.2 形態學特征

菌株HUCM115在mMRS固體培養基和液體培養基分別于37 ℃培養24 h，其生長情況及革蘭氏染色觀察菌體細胞的形態特征如圖2所示。菌株HUCM115在mMRS瓊脂培養基上形成為圓形，表面光滑有光澤，邊緣完整，低凸，質地黏稠，乳白色，菌落不透明；菌體細胞為短桿，兩端鈍圓，單在、成對排列，偶見成鏈；液體培養24 h呈混濁生長，但上層較澄清，底部有厚層沉淀，上下層界限明顯。

2.1.3 16 S rDNA序列比對分析

菌株HUCM115的16S rDNA基因經PCR擴增、純化并測序，其16S rDNA基因序列經BLAST后發現與乳桿菌屬內菌種的同源性最高。利用MEGA5.1軟件，與GenBank數據庫中已知的乳桿菌屬內模式菌株的16S rDNA基因序列進行序列比較，并以非同屬的Escherchia coli模式菌株為外標，繪制出系統發育樹，結果如圖3所示。

圖3 基于16S rDNA基因序列構建的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

由圖3可知，菌株HUCM115與Lactobacillus plantarum和L.pentosus模式株的親緣關系最近，序列相似性均大于98%，故通過16S rDNA基因序列比對分析尚無法確定菌株HUCM115的具體種。因此，選擇pheS基因序列進一步比對分析。

2.1.4pheS基因序列比對分析

為了進一步確定菌株HUCM115種的歸屬，其pheS基因被進一步擴增及測序，經BLAST后發現其pheS基因序列同樣與乳桿菌屬內菌種的同源性最高。同樣利用MEGA5.1軟件，以非同屬的Hellcobacter pylori模式菌株為外標，與已知的乳桿菌屬內模式菌株的pheS基因序列進行比較分析，繪制系統發育樹，結果如圖4所示。

圖4 基于pheS基因序列構建的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on pheS gene sequences

基于pheS基因序列構建的系統發育樹顯示，菌株HUCM115與L.plantarum模式株的親緣關系最近，且序列相似性為100%。

因此，鑒于形態學特征及16S rDNA和pheS基因序列比對分析結果，可確定HUCM115菌株為植物乳桿菌。

2.2 菌株HUCM115的酸耐受性

圖5 植物乳桿菌HUCM115在酸性環境下的存活情況Fig.5 Viability of L.plantarum HUCM115 under acidic conditions

菌株HUCM1115分別在pH 2.0、2.5和pH 3.0環境下37 ℃培養3 h，不同培養時間活菌數變化情況如圖5所示。在pH 3.0和pH 2.5酸性環境下保持3 h前后活菌數無顯著變化（P＞0.05），仍維持在109CFU/mL水平；pH 2.0酸性環境對菌株HUCM115的存活影響較大，培養1 h后活菌數從1.9×109CFU/mL降為8.4×107CFU/mL，而培養2 h后則無活菌檢出。

2.3 菌株HUCM115的膽汁耐受性

圖6 膽汁對植物乳桿菌HUCM115存活力的影響Fig.6 Effect of bile on the viability of L.plantarum HUCM115

如圖6所示，不論在0.3 g/100 mL還是0.5 g/100 mL膽汁環境下，菌株HUCM115培養1、2、3 h后活菌數與0 h相比均無顯著差異（P＞0.05），這說明菌株HUCM115處于膽汁質量濃度低于0.5 g/100 mL環境時，其菌種活力不會受到任何影響。

2.4 菌株HUCM115的自動聚集能力

圖7 植物乳桿菌HUCM115的自動聚集能力Fig.7 Auto-aggregation capacity of L.plantarum HUCM115

由圖7可知，植物乳桿菌HUCM115培養物經振蕩后發生了迅速沉降，室溫靜置30 min自動聚集百分比為15.4%，而靜置60 min則達到近70%，此時細菌懸浮液上層溶液呈澄清狀態，之后自動聚集百分比則趨于平穩無顯著變化，到第150分鐘時自動聚集百分比為72.4%。

2.5 菌株HUCM115體外去除膽固醇作用

未接種與接種植物乳桿菌HUCM115的含膽固醇培養基于37 ℃培養24 h后，分別測定培養上清液的膽固醇含量，結果如表1所示。植物乳桿菌HUCM115培養在含膽固醇培養基中24 h后，培養基中20.6%膽固醇被去除，說明該菌株具有潛在的降膽固醇特性。

表1 植物乳桿菌HUCM115的膽固醇去除能力Table 1Cholesterol-removal ability of L.plantarum HUCM115

2.6 菌株HUCM115產GABA的能力

在富含谷氨酸的培養基中，接種菌株HUCM115培養48 h后，用高效液相色譜法檢測發酵液中GABA含量，色譜如圖8所示。利用外標法以峰面積進行定量可知，植物乳桿菌HUCM115于37 ℃培養在含1%谷氨酸的TYG培養基中，孵育48 h后發酵液中GABA質量濃度可達（101.3±0.8） μg/mL。

圖8 植物乳桿菌HUCM115發酵液（A）及GABA標準品（B）的高效液相色譜圖Fig.8 HPLC profiles of fermented broth of L.plantarum HUCM115 (A)and GABA standard (B)

3 討 論

東北酸菜是一種賦有地域特色的傳統發酵食品，具有悠久的食用歷史，集獨特的風味、口感、營養于一身，這與其富含的優勢菌群密切相關，從采集的傳統自然發酵酸菜中分離篩選到1 株具有絕對生長優勢的植物乳桿菌，并對其益生特性進行研究。乳酸菌體內發揮益生功能的前提是能耐受胃液和膽汁脅迫，并以相當數量活菌黏附定植到腸道。人體空腹時胃液酸度通常為pH 1.0～2.0，攝食后則會上升至pH 5.0以上，食物在胃內消化時間大約為2～4 h[16]，故選取pH 2.0、2.5和pH 3.0三種酸性環境處理3 h評價植物乳桿菌HUCM115的酸耐受能力，其在pH 3.0酸性環境維持3 h活菌數無變化，而pH 2.0和pH 2.5環境下活菌數出現不同程度降低，尤以pH 2.0影響最大，故該菌株及其制劑適宜餐后攝入。膽汁可使細菌細胞膜溶出從而起到抗菌作用[17]，其腸道內生理含量通常為0.5%[18]，而植物乳桿菌HUCM115對其展現出了明顯抗性。乳酸菌的自動聚集能力與其黏附性正相關，可作為益生菌黏附能力篩選指標之一[12,19]，菌株HUCM115的自動聚集能力強于商業化菌株鼠李糖乳桿菌GG和嗜酸乳桿菌NCFM[12]。由此說明，植物乳桿菌HUCM115具備耐受胃液和膽汁脅迫并黏附到腸道的潛能。

人體血清膽固醇水平過高是引發心血管疾病的重要危險因素，動物及人體臨床研究已證實乳酸菌具有降膽固醇作用[20-21]，通常情況下體外可去除膽固醇的乳酸菌在體內也會表現出良好的降膽固醇作用[22-23]，因此體外篩選降膽固醇乳酸菌具有重要意義。乳酸菌對膽汁的耐受性與其膽酸鹽水解酶（bile salts hydrolase，BSH）活性有關[24-25]，并可通過BSH活性機制實現體外/體內降膽固醇作用[2,26]，故推測高膽汁抗性的菌株HUCM115可能具有BSH活性進而降膽固醇，結果顯示植物乳桿菌HUCM115可將培養基中1/5的膽固醇去除，其膽固醇去除能力與Li Yang等[22]報道的植物乳桿菌相當，但其體外去除膽固醇的確切機理仍需進一步研究確定。

GABA的產生有利于維持微生物細胞內pH值的穩態平衡，從而使其可耐受酸脅迫環境[27]，研究發現乳酸菌具有谷氨酸脫羧酶活性可催化L-谷氨酸脫羧生成GABA[28]，故對可耐酸的HUCM115菌株產GABA能力進行評價。GABA是一種在自然界分布廣泛的非蛋白質氨基酸，為一種抑制性神經遞質，可抑制血壓升高、減少抑郁的發生等[29-30]，這表明可產GABA的植物乳桿菌HUCM115在降血壓及緩解抑郁等方面可能具有一定的潛在價值。總之，植物乳桿菌HUCM115可作為候選益生菌株用于體內實驗研究以深入探究其益生功能及機制。

4 結 論

從東北酸菜中分離到1 株植物乳桿菌HUCM115，具有良好的酸和膽汁耐受性及自動聚集能力，37 ℃發酵24 h后培養基中膽固醇去除率可達20.6%，發酵48 h后GABA質量濃度可積累至101.3 μg/mL，展現出了優良的益生特性，具有潛在的應用價值。