低溫條件下希氏乳桿菌Q19蘋果酸-乳酸發酵特性及其對葡萄酒香氣成分的影響

白雪菲，金 剛，劉 思，馬 雯，張 眾，王卉青，張軍翔

（1.寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學葡萄酒學院，葡萄與葡萄酒教育部工程研究中心，寧夏葡萄與葡萄酒工程技術中心，寧夏 銀川 750021）

葡萄酒的釀造主要包括2 個不同的發酵過程：由酵母菌完成的乙醇發酵和由乳酸菌完成的蘋果酸-乳酸發酵（malolactic fermentation，MLF）[1-2]。MLF通過乳酸菌將L-蘋果酸轉化為L-乳酸，提高了葡萄酒的微生物穩定性，并且通過產生多種酶類水解揮發性物質前體釋放出多種不同的香氣物質，從而改善葡萄酒的香氣結構，提高葡萄酒的品質[3-6]。

目前，生產中應用最廣泛的MLF菌種為酒酒球菌（Oenococcus oeni），它具有優良的發酵特性和應對多種葡萄酒逆境脅迫的能力，但由于世界范圍內少數幾家商業酒酒球菌的廣泛使用，使得本土微生物資源受到威脅，也帶來葡萄酒的同質化等問題。特別是我國西部葡萄酒產區在11月份后正值MLF進行時氣溫迅速下降，在一些控溫條件差的酒廠，利用傳統商業乳酸菌進行MLF存在困難。寧夏賀蘭山東麓釀酒葡萄種植區域面積廣大，風土差異明顯，有較豐富的釀酒微生物資源，開發利用本土釀酒微生物資源，不但可以突出葡萄酒的“風土”特征，而且可以逐步篩選出適合當地環境的釀酒微生物。

目前，關于蘋果酸-乳酸細菌篩選的研究多集中于酒酒球菌[7-8]，但有學者發現和酒酒球菌一樣，乳桿菌（Lactobacillus）屬中的希氏乳桿菌（L.hilgardii）同樣具有啟動和完成MLF的能力，并產生與酒酒球菌不同的香氣物質[9]。然而，我國關于希氏乳桿菌的篩選及其對葡萄酒MLF影響的研究卻鮮有報道。近年來，研究者對能在低溫條件下完成MLF菌株的篩選越來越感興趣[10-13]。Olguín等[14]對從Patagonian紅葡萄酒中分離出的2 株酒酒球菌UNQOe4和UNQOe19分別進行低溫MLF，結果表明這2 株酒酒球菌均能在18 ℃和21 ℃完成MLF，且完成這一過程的菌株可能屬于嗜冷菌群。目前，低溫發酵通常應用于乙醇發酵，并以此改善葡萄酒的品質，但關于低溫條件下進行MLF對葡萄酒香氣的影響尚未見報道。

本研究以從寧夏賀蘭山東麓產區篩選出的1 株希氏乳桿菌Q19為研究對象，探究其在不同溫度條件下的發酵性能及其對葡萄酒香氣成分的影響，以期為希氏乳桿菌在低溫發酵中的應用提供數據支持與參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

希氏乳桿菌Q19分離自寧夏賀蘭山東麓青銅峽產區赤霞珠葡萄酒自然MLF過程中。

MRS培養基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉浸粉8.0 g/L，酵母浸粉4.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，K2HPO32.0 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，乙酸鈉5.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·4H2O 0.05 g/L，吐溫80 1.0 mL/L，加80%蒸餾水，調節pH 4.8，121 ℃滅菌20 min后，再加入20%蘋果汁。

供試酒樣：選用2017年寧夏賀蘭山東麓產區乙醇發酵結束、未啟動MLF的赤霞珠干紅葡萄酒（乙醇體積分數14.6%，殘糖3.04 g/L，pH 3.75）。

蘋果酸試劑盒（L-Malic Acid Enology Enzymatic kit）乙酸、檸檬酸、L-乳酸、總酸、總糖試劑盒（Enology Enzymatic kit） 西班牙BioSystems SA公司。

1.2 儀器與設備

7890 B氣相色譜-7000D質譜儀 美國Agilent公司；GL323l-1SCN電子天平、PB-10精密pH計 德國Sartorius公司；311 CO2培養箱 美國Thermo公司；LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；SHP-150B型生化培養箱 常州諾基儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的準備

將保藏菌劃線于MRS固體培養基，在28 ℃、厭氧條件下培養3 d。在MRS固體培養基上挑取菌落特征明顯的單菌落接種于MRS液體培養基，于28 ℃、厭氧條件下培養72 h制成種子液。

1.3.2 MLF

將乙醇發酵結束后的赤霞珠葡萄酒酒樣經0.2 μm孔徑的過濾膜進行過濾除菌，將活化菌液以1%（V/V）接種量接種于250 mL葡萄酒中，未進行MLF（添加60 mg/L SO2且不接種菌液）相同容積的葡萄酒作為對照組，均做2 個重復。滿瓶密封分別放置于10、15、20 ℃恒溫培養箱中，每4 d取樣。

1.3.3 理化指標測定

用平板計數法測定葡萄酒中的菌落總數；用蘋果酸試劑盒檢測L-蘋果酸含量；L-蘋果酸含量趨于穩定后用氣相色譜-質譜測定各酒樣的香氣成分；乙酸、檸檬酸、L-乳酸、總酸、總糖在MLF前后用總糖試劑盒試劑盒檢測。

1.3.4 香氣成分的測定

采用頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜儀對香氣物質進行提取分析。將萃取頭50/30 μm DVB/CAR/PDMS在250 ℃條件下老化10 min。取5.0 mL酒樣于頂空瓶中，加入1.5 g NaCl及10.0 μL內標物4-甲基-2-戊醇，45 ℃保溫5 min后將萃取頭插入頂空瓶，45 ℃萃取35 min。

氣相色譜-質譜條件：進樣溫度230 ℃，解吸8 min，不分流進樣，載氣為高純氦氣；流速1 mL/min；程序升溫：初始溫度40 ℃，恒溫5 min，然后以3 ℃/min升至130 ℃，以2 ℃/min升至144 ℃，以5 ℃/min升至240 ℃，保持10 min。傳輸線溫度和離子源溫度分別為240 ℃和230 ℃，電子能量70 eV，掃描范圍40～300 u。

定性：香氣成分利用質譜全離子掃描模式下的總離子流圖譜，依據色譜保留時間和質譜信息、NIST 標準譜庫比對結果以及參考相關文獻相結合的方法進行定性分析。

定量：采用內標法，各香氣成分質量濃度計算公式如下：

1.4 數據處理及分析

采用Excel 2010進行數據處理，SPSS 20.0對數據進行單因素方差分析，利用Duncan檢驗對數據進行差異顯著性分析（P＜0.05，差異顯著），對發酵酒樣的香氣物質進行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結果與分析

2.1 不同溫度條件下MLF對葡萄酒理化指標的影響

表1 供試酒樣MLF發酵前后理化指標Table 1 Physicochemical indexes of wine samples before and after MLF

從表1可以看出，在不同溫度處理條件下，L-乳酸含量顯著升高，說明菌株Q19可以使L-蘋果酸脫羧生成L-乳酸。各處理MLF后葡萄酒中總酸含量都顯著減少，15 ℃和20 ℃發酵總酸降低最為顯著。揮發酸含量是判斷葡萄酒健康狀態的指標[15]，也是評判乳酸菌發酵特性的指標，各處理均低于國家標準，其中15 ℃與其他處理組相比，揮發酸含量最低。另外，各處理組MLF后酒樣中檸檬酸和總糖含量均有微量降低。

2.2 不同溫度條件下MLF過程中菌密度變化

圖1 不同溫度發酵菌株Q19菌密度變化Fig.1 Changes in cell density of L.hilgardii Q19 during MLF at different temperatures

如圖1所示，菌株Q19活化后接入葡萄酒中進行不同溫度MLF，菌密度均呈現先下降后穩定的狀態。從接種后到第8天，10、15 ℃與20 ℃發酵酒樣相比，菌密度有明顯的下降；接種8 d后，20 ℃發酵酒樣的菌密度趨于穩定，并保持在107CFU/mL；而10、15 ℃發酵酒樣的菌密度分別在發酵24 d和12 d呈現先下降后上升的趨勢，最后趨于穩定并保持在106CFU/mL；在接種24 d后，各處理酒樣的菌密度仍保持在106～107CFU/mL。

2.3 不同溫度條件下MLF后葡萄酒中L-蘋果酸含量的變化

如圖2所示，菌株Q19接入葡萄酒中進行不同溫度條件下的MLF，L-蘋果酸含量均有所下降。接種后第8天，與初始L-蘋果酸含量相比，10、15 ℃和20 ℃發酵酒樣中L-蘋果酸含量分別降低了17.5%、 40.6%和45%；在接種28 d后，10 ℃發酵酒樣的L-蘋果酸質量濃度仍有0.87 g/L，盡管菌密度保持在106CFU/mL，說明菌株Q19在10 ℃條件下MLF活性受到抑制；而15 ℃發酵酒樣的L-蘋果酸降到0.27 g/L，表現出了良好的L-蘋果酸分解能力，表明菌株Q19在15 ℃條件下具有完成MLF的能力。

圖2 不同溫度發酵L-蘋果酸含量變化Fig.2 Changes in L-malic acid content during MLF at different temperatures

2.4 不同溫度條件下MLF后葡萄酒香氣物質

如表2所示，酒樣共檢測到62 種揮發性化合物，包括18 種醇類，34 種酯類，3 種有機酸，3 種其他類化合物和4種萜烯類物質。其中未經MLF的酒樣中香氣物質檢測總量和種類分別為217.48 mg/L和46 種，菌株Q19在10、15 ℃和20 ℃條件下進行MLF后，香氣物質檢測總量和種類數分別為182.55 mg/L和41 種、209.99 mg/L和52 種、194.66 mg/L和48 種。與未經MLF的酒樣相比，各處理酒樣香氣物質檢測總量均有所下降，但15 ℃和20 ℃處理顯著增加了可檢測物質的種類，其中15 ℃處理增加了正辛醇、庚酸乙酯、壬酸乙酯、乳酸乙酯、十一酸乙酯、正癸醛和萜烯類化合物含量，以及萜烯類化合物的種類。

表2 不同溫度條件MLF前后葡萄酒香氣類別及含量Table 2 Types and contents of aroma components in wine before and after MLF at different temperatures

續表2

2.5 不同溫度條件下MLF后酒樣香氣物質的PCA

圖3 不同香氣物質在前2 個主成分上的載荷及處理酒樣分布Fig.3 PC1 versus PC2 loadings plot for different aroma compounds with distribution of experimental and control samples shown in it

為了進一步分析不同溫度條件下MLF對香氣物質的影響，將供試酒樣進行PCA，以特征值大于1為依據，提取2 個主成分，PC1（39.78%）和PC2（33.19%）的累計方差貢獻率為72.97%。由圖3可知，與PC1高度正相關的為庚酸乙酯、壬酸乙酯、乳酸乙酯、十一酸乙酯、正辛醇、里那醇、松油烯和β-蒎烯，而乙酸異戊酯、正己酸乙酯、甲酸辛酯和3-甲基-1-戊醇與PC1呈負相關；對PC2起貢獻作用的香氣物質主要有苯甲醇、苯乙醇、正癸醇、異戊醇和乙酸苯乙酯等，與辛酸、十三酸乙酯和3-羥基丁酸乙酯呈負相關?？梢钥闯?，發酵酒樣中，15 ℃發酵酒樣在PC1的正半軸得分最高，庚酸乙酯、乳酸乙酯、壬酸乙酯、十一酸乙酯、正辛醇、β-蒎烯、里那醇和松油烯含量較高，賦予葡萄酒獨特的花香、果香，增加了其香氣復雜性；20 ℃發酵酒樣在PC2正半軸的得分較高，對其香氣起貢獻作用的物質主要是香茅醇和異丁醇；10 ℃發酵酒樣在PC2的負半軸得分最高，辛酸和3-羥基丁酸乙酯含量較高，使其表現出較多的果香和脂肪味。

3 討 論

希氏乳桿菌Q19在不同溫度條件下進行MLF，檸檬酸和總糖含量均有少量降低，表明希氏乳桿菌Q19可以對糖、檸檬酸進行代謝[9]，但本研究中不同溫度條件下MLF后揮發酸沒有顯著升高；發酵溫度對揮發酸含量影響不顯著；總酸含量各處理組顯著低于對照組，說明菌株Q19在MLF過程中具有一定的降酸能力。

菌株Q19接入葡萄酒中后，各處理酒樣菌密度均呈現先下降后穩定的狀態，在接種8 d后，各處理酒樣的菌密度保持在106～107CFU/mL之間，與Lerm等[24]的研究結果基本一致，這主要是由于菌株細胞剛接入葡萄酒中后，其苛刻的環境導致乳酸菌的生長速率低于死亡速率，從而導致活菌的數量下降。在接種28 d后，15 ℃與20 ℃發酵酒樣的L-蘋果酸分別降到0.27 g/L和0.15 g/L，而10 ℃酒樣L-蘋果酸質量濃度仍然保持在0.87 g/L，盡管其菌密度仍保持在106CFU/mL，可能是低溫抑制了其蘋果酸-乳酸酶活性[25]，且能在低溫下完成MLF可能也與菌株中相關基因的表達有關[26-27]。李維新[25]通過研究溫度對蘋果酸-乳酸酶活性的影響時發現，在生長溫度為15～35 ℃內，植物乳桿菌R23蘋果酸-乳酸酶的活力隨著溫度的上升而增高。Olguín等[14]通過對菌株UNQOe19和UNQOe4分別在18 ℃和21 ℃培養48 h后相關的基因進行實時聚合酶鏈式反應，結果表明應激基因rmlB和hsp20在21 ℃時表達水平降低，但在18 ℃表達量顯著增加。在本研究中，15 ℃較20 ℃發酵相比，對菌株Q19消耗蘋果酸的影響不顯著，而在10 ℃條件下，消耗蘋果酸能力降低，表明15 ℃對希氏乳桿菌Q19蘋果酸-乳酸酶活性影響不顯著，10 ℃可能對其蘋果酸-乳酸酶活性產生較大的抑制作用。

對于揮發性香氣化合物，低溫發酵能保留葡萄酒中的一些風味物質[28]，也是發酵過程中唯一能人為控制的因素。葡萄酒中的醇類物質主要是由己糖或氨基酸通過丙酮酸途徑產生，在MLF過程中，由于乳酸菌菌株代謝過程中酶活性不同，最終導致代謝產物及次級代謝產物不同[29]。在各處理中，15 ℃發酵酒樣高級醇類物質含量最高，其中正辛醇（茉莉、檸檬香）和苯乙醇（玫瑰花香）含量均高于10、20 ℃發酵，且苯乙醇含量超過其相應的閾值，這為葡萄酒賦予一定的檸檬香、玫瑰花和薔薇等香氣起到積極作用。

酯類物質是葡萄酒中重要的揮發性化合物，大多數酯類可產生令人愉悅的香氣，通常呈現水果香味[30]。在MLF過程中，酯類物質的合成與水解主要與乳酸菌中的酯酶及其活性有關[31]。經過不同溫度MLF，15 ℃處理的酯類物質種類以及乙醇酯類物質含量均高于對照與其他處理，這些物質對于葡萄酒果香、花香和香料香氣味具有積極的貢獻。Pérez-Martín等[32]研究了溫度對243 株乳酸菌酯酶活性的影響，發現70%的菌株酯酶活性在15 ℃時高于其他溫度，這對葡萄酒香氣可能具有潛在的影響。周安玲等[29]在研究乳酸菌對干紅葡萄酒揮發性成分影響時發現，來源于泡菜中的植物乳桿菌C5由于其酯酶活性較高，從而促進了酯類物質的形成。

酸類物質除本身是香氣成分外，還能和醇在酯酶催化作用下形成酯類物質，增加葡萄汁或酒的香氣物質種類[21]。由本研究可知，各處理有機酸含量均高于對照組，其中10 ℃發酵增加了辛酸含量，15 ℃和20 ℃發酵均降低了辛酸含量，增加了正癸酸含量。

萜烯類化合物來源于葡萄果實本身，主要以糖苷鍵合態形式存在，釀造過程中可在糖苷酶作用下轉變為揮發性的游離態香氣化合物，從而賦予葡萄酒品種香氣特征[33]。本實驗酒樣共檢測出4 種萜烯類物質，在15 ℃處理酒樣中，這4 種萜烯類物質均檢測出并且總含量最高，對照和20 ℃發酵酒樣僅檢測到香茅醇的存在，10 ℃發酵酒樣未檢測到萜烯類物質。其中15 ℃發酵酒樣產生的里那醇（百合花、果香）和香茅醇（檸檬、柑橘香）含量均超過感官閾值，這些物質賦予葡萄酒一定的花香、果香，增加了葡萄酒香氣的復雜性。羰基類化合物主要來源于微生物的發酵，與對照相比，10 ℃和15 ℃發酵增加了羰基化合物含量，20 ℃發酵降低了其含量。其中15 ℃發酵產生的正癸醛（甜橙和橘子香氣）含量高于對照和其他處理，且超過相應的感官閾值，這對酒體香氣特征起重要的貢獻作用。

關于溫度及其他非生物脅迫對希氏乳桿菌Q19應激基因表達、酶活性以及有關物質代謝等方面的研究仍需進一步探索，以便更深入地理解希氏乳桿菌Q19的生理和代謝特點，為更好地應用于生產提供基礎和依據。

4 結 論

希氏乳桿菌Q19在10、15、20 ℃條件下，啟動MLF將蘋果酸轉化成乳酸，在15、20 ℃條件下，菌株表現出良好的蘋果酸分解能力，啟動發酵28 d內蘋果酸質量濃度分別降到0.27 g/L和0.15 g/L，但在10 ℃條件下，啟動發酵28 d內蘋果酸質量濃度仍保持在0.87 g/L，MLF速度受到較大影響。10、15 ℃條件下，菌株對檸檬酸和糖進行了少量的代謝，但發酵后揮發酸升高不顯著。在不同溫度條件下，希氏乳桿菌Q19 MLF后的香氣物質類別具有顯著差異，與20 ℃發酵相比，15 ℃條件下發酵后葡萄酒中香氣物質的種類與含量更豐富，其中正辛醇、庚酸乙酯、壬酸乙酯、乳酸乙酯、十一酸乙酯、正癸醛和萜烯類物質含量增加，賦予了葡萄酒獨特的花香、果香等香氣特征。結果表明希氏乳桿菌Q19能在15 ℃低溫條件下啟動并完成MLF，并能提升葡萄酒的香氣質量，因而具有較高的商業化價值。