腸膜明串珠菌ATCC8293中乳酸脫氫酶的特性

李 玲，龔金炎，袁海娜，方若思，楚秉泉，肖功年,，Namsoo HAN

（1.浙江科技學院生物與化學工程學院，浙江 杭州 310023；2.韓國忠北大學食品科學與工程專業，韓國 忠清北道 清州 28644）

乳酸菌是降解可發酵性碳水化合物產生乳酸的一類無芽孢、革蘭氏陽性菌的統稱。目前，乳酸菌可分為20 個屬，共有200多種。乳酸菌可作為各種不同發酵食品的發酵劑，如酸奶、奶酪和蔬菜發酵食品[1-3]。其中，腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroidessubsp.mesenteroidesATCC8293）是一種G＋C含量低于50%的異型發酵乳酸菌。在發酵過程中產生檸檬酸、蘋果酸等有機酸和芳香族化合物，能夠有效地提升發酵食品的品質，作為發酵劑應用于發酵食品產業中[4-6]。

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）是乳酸菌產生乳酸代謝途徑中的關鍵酶，其催化丙酮酸轉化成乳酸。根據催化產物不同，LDH分為D-LDH（EC：1.1.1.28）和L-LDH（EC：1.1.1.27）兩種，分別產生D-乳酸和L-乳酸[7]。LDH也是乳酸菌產生苯乳酸的關鍵酶，LDH轉化苯丙酮酸產生苯乳酸[8]。苯乳酸是一種新型的抑菌物質，能夠抑制多種食源性致病菌和真菌。苯乳酸也分為D-苯乳酸和L-苯乳酸，其中D-苯乳酸比L-苯乳酸有更高的抗菌活性[9]。苯乳酸的抑菌譜寬、抑菌能力強，具有良好的溶解性和熱穩定性，非常有潛力發展成一種新型的生物防腐劑用于食品、飼料等領域[10-11]。在前期研究中，從不同乳酸菌中篩選高產苯乳酸的乳酸菌，其中，腸膜明串珠菌ATCC8293生產苯乳酸的效率達到80%[12]。結果表明，腸膜明串珠菌ATCC8293參與苯乳酸代謝的LDH的活性高。腸膜明串珠菌ATCC8293中含有7 種LDH，經蛋白質組學分析，其中3 種基因LEUM_1756、LEUM_2043、LEUM_0445能夠有效表達[12]。對LEUM_1756基因已測定酶學特性，證實了LEUM_1756是腸膜明串珠菌ATCC8293中的關鍵LDH。LEUM_2043基因的轉錄量和翻譯量是LEUM_1756的70%和40%，表明該基因也能參與乳酸和苯乳酸的生產代謝[13]。因此，對腸膜明串珠菌ATCC8293的次要關鍵酶LDH（LEUM_2043）進行進一步研究，為利用腸膜明串珠菌生產乳酸和苯乳酸提供理論依據。

目前，有關乳酸菌LDH的酶學性質研究已很多，大多是將基因導入到大腸桿菌（Escherichia coli），得到重組純化酶，研究酶學性質。已對來自植物乳桿菌、乳酸片球菌、詹氏乳桿菌的LDH進行酶學特性研究[14-17]。雖然對LDH的研究很多，但是對于腸膜明串珠菌的LDH的研究卻很少，不同LDH性質也存在較大差異。本研究將采用基因工程的方法，以腸膜明串珠菌ATCC8293為研究對象，克隆ldh基因，并導入E.coli中表達，經Ni-NTA柱親和層析進行純化。測定純化后酶的比活力，并且研究酶學性質，包括最適pH值和溫度、對不同底物的酶活力及動力學常數。鑒于其在合成乳酸中的關鍵作用，可為高效生產乳酸、苯乳酸等有效成分物質提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株、質粒和培養基

腸膜明串珠菌ATCC8293 美國ATCC微生物菌種保藏中心；E.coliMC 1061、E.coliBL21(DE3)、質粒pETDuetTM-1 德國Novagen公司；MRS培養基、LB培養基 美國BD Difco公司。

1.1.2 試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA快速回收純化試劑盒、膠回收試劑盒 韓國Bioneer公司；ExTaqDNA聚合酶、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒、限制性內切酶EcoR I和PstI 日本TaKaRa公司；BCA試劑盒 美國Pierce Biotechnology公司；氨芐青霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、丙酮酸、D-/L-乳酸、還原態煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、α-酮丁酸、草酰乙酸、苯丙酮酸、2-酮戊二酸、乙酰丙酸 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

Ni-NTA柱 瑞典GE Healthcare公司；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀韓國Younglin公司。

1.3 方法

1.3.1 重組質粒pETldh的構建

以腸膜明串珠菌ATCC8293基因組為模板，用LEUM_2043-N（5’-TTGAATTCAATGAAAATTTTAATG TACAAT-3’）和LEUM_2043-C（5’-TTCTGCAGCCGC AAAATTTCGTTTTC-3’）作為引物進行PCR擴增。PCR產物經DNA回收試劑盒回收，同時在1%瓊脂糖凝膠上電泳鑒定其分子質量大小。純化的ldh基因產物插入到pETDuetTM-1質粒（5 420 bp）的EcoR I和PstI酶切位點上，得到表達質粒pETldh（6 394 bp）。將得到的質粒轉化至E.coliMC 1061感受態細胞中，在氨芐青霉素質量濃度為100 μg/mL的LB培養基中選菌落經酶切鑒定后挑取陽性重組子進行測序。

1.3.2 組菌pETldh的蛋白表達及純化

為過表達重組質粒pETldh，將其轉化到至E.coliBL21(DE3)感受態細胞中進行表達。將E.coliBL21(DE3)/pETldh接種于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，250 r/min、37 ℃培養至OD600nm達到0.5，加入1 mmol/L IPTG誘導表達。收集菌體發酵液12 000 r/min、4 ℃離心5 min，棄上清液。菌體以裂解液（10 mmol/L咪唑、500 mmol/L NaCl、20 mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4緩沖液，pH 7.4）洗滌，再超聲裂解10 min。將裂解液12 000 r/min、4 ℃離心5 min，上清液作為粗酶液。依據重組蛋白的His標簽，粗蛋白用Ni-NTA柱進行親和層析純化。用洗脫液（500 mmol/L咪唑、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，pH 7.4）洗脫，4 ℃保存使用。蛋白樣品經變性十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析表達與純化水平。

1.3.3 LDH活力測定

丙酮酸還原反應的總反應體系3 mL：0.5 mmol/L NADH、10 mmol/L丙酮酸、0.01 mL酶液、0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）。由于反應過程中需要輔酶NADH的參與，根據NADH在340 nm波長處吸光度的減少速率定義酶活力。1 min減少1 μmol NADH所需酶量為1 個酶活力單位；1 mg酶蛋白所含的酶活力單位數（U/mg）為比活力。使用BCA試劑盒測定蛋白含量。

采用HPLC分析該酶的反應產物。色譜條件：色譜柱Shodex ORpac CRX853（8.0 mm×50 mm，6 μm）；檢測器：紫外檢測器；流動相：1.00 mmol/L CuSO4溶液；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；波長：250 nm；進樣量：10 μL。

1.3.4 溫度和pH值對LDH的影響

分別在不同pH值緩沖液測定酶活力，最適pH值定義為最高酶活力（以相對酶活力100%計）所對應的pH值。緩沖液配制如下：pH 6.0～7.0為100 mmol/L磷酸緩沖液，pH 8.0～10.0為100 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH 11.0～13.0為100 mmol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。分析溫度對LDH的影響，將反應液分別在10、20、30、40、50 ℃進行反應，最適溫度定義為最高酶活力（以相對酶活力100%計）所對應的溫度。

1.3.5 LDH對不同底物的酶活力及動力學常數測定

由于LDH具有較寬的底物譜系，因此，選取與丙酮酸結構相似的5 種底物（乙酰丙酸、苯丙酮酸、α-酮丁酸、草酰乙酸、2-酮戊二酸）測定LDH對不同底物的酶活力，以丙酮酸用作底物時為最高酶活力（以相對酶活力100%計）。測定LDH分別對丙酮酸及輔酶NADH的動力學常數，反應在最適溫度和pH值條件下，丙酮酸濃度為1、2、4、5、10 mmol/L（NADH濃度0.5 mmol/L），NADH濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L（丙酮酸濃度10 mmol/L），計算Km、Vmax、Kcat。

1.4 數據處理

每個實驗重復3 次，每次3 個平行，采用SigmaPlot 10.0進行數據處理分析及圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 重組質粒的構建與鑒定

利用設計的引物對LDH進行PCR擴增，獲得996 bp的PCR產物。純化的ldh基因產物插入到pETDuetTM-1質粒（5 420 bp）的酶切位點上，獲得重組質粒pETldh（6 394 bp）。對其進行雙酶切之后，在1%瓊脂糖凝膠上電泳鑒定得到相應的目的基因的片段被切出。同時基因測序結果與目的基因一致，表明ldh基因成功克隆到pETDuetTM-1質粒獲得重組載體pETldh。

2.2 ldh基因誘導表達分析

將已構建的重組質粒pETldh轉入到E.coliBL21(DE3)感受態細胞中。E.coliBL21(DE3)/pETldh在LB培養基中培養，經過IPTG誘導表達，對菌體蛋白經預處理后進行SDS-PAGE分析。未加入IPTG的E.coliBL21(DE3)/pETldh菌體作為對照組。結果顯示，與對照組相比，重組菌株經過誘導表達后在分子質量約37 kDa處有一條明顯蛋白帶出現，說明構建的重組質粒pETldh成功實現ldh基因的表達（圖1）。通過Ni-NTA親和層析柱純化后的蛋白條帶單一，與預測分子質量相似。

圖1 重組D-LDH的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of purification of expressed LDH

2.3 LDH活力及反應產物分析

表1 LDH在純化前后的酶活力Table 1 Summary of LDH purification

如表1所示，LDH粗酶液對丙酮酸的比活力為40.77 U/mg，經過純化之后比活力達到67.45 U/mg。其酶活力遠低于來自同一種腸膜明串珠菌內其他LDH（LEUM_1756）的比活力（4 450 U/mg）[12]，但是相對于來自其他腸膜明串珠菌亞種或其他乳酸菌屬的LDH，其酶活力較高，如來自腸膜明串珠菌NCDO（0.6、0.9 U/mg，2 種基因LDH，下同）、鼠李糖乳桿菌（0.02、0.21 U/mg）的LDH[18-19]。近年來，有研究利用帶有高活性LDH的微生物有效合成乳酸，作為聚乳酸、苯乳酸等物質的前提物質[20-21]。

利用純化后的LDH催化丙酮酸與NADH反應后，用HPLC檢測LDH能否轉化丙酮酸生成乳酸，并且確定產生乳酸是D-型或L-型。由圖2a可以看出，D-乳酸和L-乳酸分別在第10分鐘和第8分鐘的保留時間檢測到。由圖2c可以看出，在第10分鐘左右明顯出現D-乳酸的峰，說明LDH可還原丙酮酸生成D-乳酸的D-LDH。研究表明，腸膜明串珠菌作為主要發酵劑的蔬菜發酵中主要產生D-乳酸，是一種生產D-型乳酸或苯乳酸代表性乳酸菌[22-23]。因此，可推測腸膜明串珠菌中含有的LDH中，主要表達的基因均為D-型ldh。已證實酶特性的蛋白質表達量高的2 個ldh基因LEUM_1756和LEUM_2043均表達為D-LDH。

圖2 LDH還原丙酮酸生成乳酸的HPLCFig.2 HPLC analysis of lactic acid produced from pyruvate with LDH

2.4 LDH的最適pH值和溫度

如圖3a所示，LDH活力在pH 7.0～9.0之間相對穩定；在pH值小于6.0或大于10.0時酶活力顯著降低；在pH 7.0時具有最大酶活力。其在pH 7.0時具有相對高活性，這與His-標簽純化系統的最適pH值相同，能夠減少純化過程中的復雜操作。大部分來自乳酸菌的LDH都在pH 6.6～8.0之間相對穩定，這與乳酸菌最適生長pH值有關[24]。如圖3b所示，LDH在30～50 ℃相對穩定；在40 ℃時具有相對高活性；溫度大于50 ℃時顯著降低；60 ℃之后，相對酶活力降到60%以下。來自同種腸膜明串珠菌內其他LDH（LEUM_1756）和其他乳酸菌的D-LDH相比，其酶對溫度穩定性范圍相對較寬[25-26]。

圖3 pH值（a）和溫度（b）對LDH活力的影響Fig.3 Effects of pH (a) and temperature (b) on LDH activity

2.5 不同底物酶活力及動力學參數

表2 LDH對不同底物的相對酶活力Table 2 Relative activity of LDH with different substrates

表2結果顯示，LDH對多種底物的催化能力不同，大小順序為草酰乙酸＞苯丙酮酸＞α-酮丁酸＞2-酮戊二酸。腸膜明串珠菌LDH對不同底物的相對酶活力與發酵乳桿菌LDH很相似[27]。其中，對草酰乙酸（16.19 U/mg）和苯丙酮酸（11.47 U/mg）的催化能力較強，對其他底物的催化能力很低，如對α-酮丁酸和2-酮戊二酸的活力為8.09 U/mg和1.35 U/mg。來自腸膜明串珠菌的LDH對苯丙酮酸的活力高于來自詹氏乳桿菌的LDH（7、9 U/mg），證實了腸膜明串珠菌ATCC8293苯乳酸生產率優于其他乳酸菌菌種[17]。但是，其對α-酮丁酸的活力低于來自詹氏乳桿菌的LDH（41、68 U/mg）[17]。利用LDH對其他底物的特性，已成功實現苯乳酸、羥基丁酸等有效成分的高效生物合成[28-29]。

以丙酮酸和NADH為底物，在該酶最適反應條件下測定酶動力學參數。LDH對丙酮酸和NADH的Km分別為1.27 mmol/L和0.48 mmol/L，對于丙酮酸的Kcat和Kcat/Km分別為421 s-1和3.31×105L/（mol·s）。雖然本研究測定的D-LDH的Kcat/Km值比來自同種腸膜明串珠菌的另一種D-LDH（LEUM_1756）值低，但是比來自其他乳酸菌如詹氏乳桿菌、乳酸片球菌的LDH的值高出3 倍和2 倍多[25,30]。結果表明，來自腸膜明串珠菌的D-LDH對丙酮酸的親和力和催化效率高，有利于利用腸膜明串珠菌生產D-乳酸及D-苯乳酸具有潛力。

3 結 論

本研究以腸膜明串珠菌ATCC8293基因組為模板，成功構建了攜帶乳酸和苯乳酸合成途徑關鍵酶ldh基因的重組表達載體pETldh，實現其在E.coliBL21(DE3)中的高效異源表達。與其他乳酸菌LDH的酶學性質比較，腸膜明串珠菌LDH具有高的比活力，是轉化丙酮酸為D-乳酸的D-LDH，并且對丙酮酸底物的親和力和催化效率遠大于其他乳酸菌LDH。此外，其對pH值和溫度穩定性范圍相對較寬。本研究進一步提供了利用腸膜明串珠菌高效生產乳酸和苯乳酸的理論依據。