新疆伊犁地區(qū)乳制品中乳酸菌發(fā)酵和益生特性及其復(fù)合發(fā)酵方案優(yōu)化

蔡靜靜，張亞川，李 谞，張 艷，倪永清

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

乳酸菌是指一類可以利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌，乳酸菌被應(yīng)用于人類生活的方方面面，如改善食品風(fēng)味、延長食品儲藏期、促進(jìn)人體健康。

酸乳是乳酸菌在代謝過程中發(fā)生酸化作用得到的一款產(chǎn)品，乳酸菌會對牛乳的理化、感官和微生物組成產(chǎn)生重大影響[1]。發(fā)酵乳生產(chǎn)過程中使用的乳酸菌主要包括發(fā)酵劑乳酸菌、非發(fā)酵劑乳酸菌以及益生乳酸菌。發(fā)酵劑乳酸菌是一類能夠在乳制品中生長并能產(chǎn)酸凝乳的乳酸菌[2]，通常通過評估乳酸菌的產(chǎn)酸速率、產(chǎn)香特性以及改善酸乳質(zhì)構(gòu)的能力篩選發(fā)酵劑乳酸菌[3]。傳統(tǒng)酸乳通常以保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌作為發(fā)酵劑[4]，盡管一些保加利亞乳桿菌具有耐受消化道胃腸液的能力，但是與大多數(shù)人用益生菌相比，保加利亞乳桿菌不具有宿主同源性，因此，在酸乳生產(chǎn)中經(jīng)常會添加一些常用的益生菌提高酸乳的保健價值[5]。益生菌被定義為具有活性的、當(dāng)達(dá)到一定施用量時會對宿主產(chǎn)生有益作用的微生物[6]。益生菌應(yīng)具有非致病性和非產(chǎn)毒性、抑制病原菌生長、耐受胃腸道環(huán)境等特性[7-9]，并且還應(yīng)具有一定的黏附性[10-11]。乳酸菌通常被認(rèn)為是安全（generally regarded as safe，GRAS）的益生菌，廣泛應(yīng)用于食品和藥品的生產(chǎn)中[12]。

新疆是少數(shù)民族聚居區(qū)之一，少數(shù)民族同胞獨(dú)特的文化習(xí)俗以及生活習(xí)慣，為優(yōu)良發(fā)酵劑乳酸菌以及益生型乳酸菌的開發(fā)提供了豐富的資源。本研究旨在通過對新疆伊犁地區(qū)傳統(tǒng)乳制品中分離出乳酸菌的發(fā)酵和益生特性進(jìn)行研究，為開發(fā)出一款益生型酸奶提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：XKN1-5為Leuconostoc lactis；BSTS6-1、BSTS6-3、BSTS6-4為Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus；BST2-3為Lactobacillus fermentum；XSXN1-1、XSXN1-2為Streptococcus thermophilus。均為實驗室前期從新疆伊犁地區(qū)傳統(tǒng)乳制品中分離得到。

病原指示菌：出血性大腸埃希氏菌（CICC 21530）、致瀉大腸埃希氏菌（CICC 10411）、鼠傷寒沙門氏菌（CICC 10420）、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌（CICC 10421）、單核細(xì)胞性李斯特菌（CGMCC 1.9136）、血清型腸炎沙門氏菌（CGMCC 1.10754）、金黃色葡萄球（CICC 21600），購自中國工業(yè)微生物菌種保存管理中心。

全脂乳粉（蛋白質(zhì)38%、脂肪53%） 新疆石河子花園乳業(yè)有限公司；丁二酮 北京索萊寶生物科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TA.XTPlus質(zhì)構(gòu)儀 英國SMS公司；RVDV-III流變儀 美國Strider Tech公司；UV1240外分光光度計 中國睿誠永創(chuàng)公司；5417R高速冷凍離心機(jī)德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌發(fā)酵性能分析

1.3.1.1 乳酸菌酸化能力

將單菌株發(fā)酵劑以2%的接種量接種于復(fù)原乳中，記錄凝乳時間，并將樣品置于4 ℃保藏備用，取5.0 g冷藏24 h的酸乳樣品并加入5 滴0.5%酚酞指示劑，用0.1 mol/L標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定至粉紅色，1 min不消失為宜。記錄NaOH消耗量及酸乳質(zhì)量[13]。計算如式（1）所示：

式中：X1為試樣的酸度/（°T）；C1為NaOH濃度/（mol/L）；V1為樣品消耗NaOH溶液體積/mL；V0為空白消耗NaOH溶液體積/mL；100為100 g試樣；M1為試樣的質(zhì)量/g；0.01為酸度理論定義NaOH濃度/（mol/L）。

1.3.1.2 酸乳感官評價

組織食品專業(yè)的20 名研究生，對酸乳樣品的色澤、風(fēng)味、組織狀態(tài)進(jìn)行感官評價。感官評價細(xì)則參考熊政委等[14]，具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 感官評分細(xì)則Table 1 Criteria for sensory evaluation

1.3.1.3 乳酸菌對酸乳質(zhì)構(gòu)特性的影響

全質(zhì)構(gòu)分析：利用物性測試儀，P/36 R探頭。測試前速率：5.00 mm/s；測試速率：1.00 mm/s；測試后速率：5.00 mm/s；測試距離：30 mm；感應(yīng)力：Auto(Force)-2 g。由質(zhì)構(gòu)特性曲線圖得出表征質(zhì)構(gòu)狀況的評價參數(shù)硬度、黏附性、彈性、內(nèi)聚性和膠黏性[15]。

表觀黏度測定：由DHR流變儀在flow peak模式下，剪切速率為10 s-1，在25 ℃條件下測定[16]。

保水性測定：稱取15 g酸乳樣品于50 mL離心管中，10 000×g離心20 min，酸乳的保水率用離心后剩余沉淀質(zhì)量與樣品質(zhì)量比值表示[17]。

1.3.1.4 乳酸菌產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)能力分析

參考萬金敏[18]的方法進(jìn)行測定。

1）雙乙酰含量測定

丁二酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取15 μL丁二酮溶于蒸餾水中，定容至500 mL。分別量取丁二酮標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL于編號的12 支雙排放置試管中，并用蒸餾水補(bǔ)足至10 mL。向前排6 支試管中加1%的鄰苯二胺溶液0.5 mL，后排6 支試管不加鄰苯二胺溶液，充分混勻后于黑暗處反應(yīng)30 min。反應(yīng)完全后加4.0 mol/L鹽酸進(jìn)行終止反應(yīng)（前排試管加2.0 mL，后排試管加 2.5 mL，搖勻后以后排試管為空白對照，用紫外分光光度計在335 nm波長下測定吸光度。以丁二酮濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.116 2x＋0.040 7，R2=0.999 9，計算雙乙酰含量。

丁二酮含量的測定：取待測酸乳樣品，用16%三氯乙酸溶液等體積與其混合，混勻后靜置10 min，3 500×g離心10 min。取上清液20 mL，等體積加入2 個試管中，向1號試管中加入1%的鄰苯二胺溶液0.5 mL，2 號試管不加，充分混勻后于黑暗處使其反應(yīng)30 min，然后向2 個試管中加入4.0 mol/L的鹽酸終止反應(yīng)（1號試管加2.0 mL，2號試管加2.5 mL），混勻后以2號試管作為對照液，在335 nm波長測定吸光度。如果樣品中丁二酮含量較高，測得的吸光度超過0.2～1.0范圍，可用8%三氯乙酸對樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂屘幚怼?/p>

2）乙醛含量測定

試劑配制：稱取12.70 g碘于500 mL燒杯中，加入40 g碘化鉀，加適量的水溶解，移至1 000 mL棕色容量瓶，定容搖勻，配制成0.1 mol/L碘標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后準(zhǔn)確量取10.00 mL的0.1 mol/L碘標(biāo)準(zhǔn)溶液于100 mL棕色容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻，兩種溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

樣品測定：取1% NaHSO3溶液5 mL置于250 mL錐形瓶中，加入處理后試樣上清液25 mL，混勻后在室溫下放置1 h，然后加入1%淀粉溶液1 mL，用0.1 mol/L碘液滴定至接近淡藍(lán)紫色，再用0.01 mol/L碘液滴定至淡藍(lán)紫色，并且在30 s內(nèi)淡藍(lán)紫色不褪去，以上滴定均不計數(shù)。然后加入20 mL 1 mol/L的NaHCO3溶液，充分振蕩混勻，使溶液藍(lán)紫色消失，最后用0.01 mol/L碘液滴定至藍(lán)紫色終點，記錄消耗標(biāo)準(zhǔn)碘液的體積，每個樣品有2 個平行，并同時做空白實驗。

式中：M為乙醛質(zhì)量濃度/（mg/L）；V1為滴定樣品消耗碘標(biāo)準(zhǔn)溶液體積/mL；V2為滴定空白消耗碘標(biāo)準(zhǔn)溶液體積/mL；C為碘標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度/（mol/L）；25為樣品稱樣量/mL；0.022為乙醛反應(yīng)化學(xué)基本單位/g。

1.3.2 乳酸菌益生特性分析

1.3.2.1 抑菌特性

用培養(yǎng)18 h的病原指示菌（濃度為107CFU/mL）100 μL，牛津杯法測定菌株抑菌能力。取37 ℃培養(yǎng)36 h的菌株菌懸液，10 000×g離心10 min后用1 mol/L NaOH溶液將pH值調(diào)至6.0，并用過氧化氫酶和胰蛋白酶處理上清液，然后用22 μm濾膜過濾，滅菌后取200 μL加入牛津杯中，將平板置于4 ℃靜置5 h，直至上清液擴(kuò)散到瓊脂中。37 ℃培養(yǎng)24 h后，使用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑[19]。

1.3.2.2 菌株黏附性

參考趙圣明等[20]的方法測定菌株的疏水性和自凝集性。

疏水性：將菌株發(fā)酵液4 000×g離心20 min，用生理鹽水洗滌2 次后重懸于0.1 mol/L KNO3（pH 6.2）溶液中，調(diào)節(jié)菌懸液濃度為107CFU/mL，600 nm波長處測定樣品吸光度（A0）；分別吸取1 mL二甲苯、乙酸乙酯、氯仿溶劑加到3 mL菌液中混勻，室溫放置10 min后渦旋振蕩2 min，室溫靜置20 min后取水相，測定其在600 nm波長處的吸光度（A1）。細(xì)菌疏水率用式（3）計算：

自凝集能力：將菌株發(fā)酵液4 000×g離心20 min，用磷酸鹽緩沖液洗滌2 次后調(diào)節(jié)菌懸液濃度為107CFU/mL。取5 mL菌懸液于10 mL試管中漩渦振蕩10 s，在室溫條件下靜置5 h，每隔1 h取出菌懸液置于600 nm波長處測其吸光度。每組3 個平行實驗。菌株自凝集率用式（4）計算：

式中：At為菌懸液在1、2、3、4 h和5 h不同時間的吸光度；A0為第0小時的吸光度。

1.3.2.3 耐受胃腸液能力

胃蛋白酶溶解于無菌磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 3.0）中制備成終質(zhì)量濃度為3 g/L的模擬胃液[21]。胰蛋白酶溶解于含有0.3%牛膽鹽的無菌磷酸鹽緩沖溶液中（0.2 mol/L，pH 8.0）中制成胰蛋白酶終質(zhì)量濃度為1 g/L的模擬腸液[22]。

將菌株培養(yǎng)至對數(shù)期后，4 ℃、4 000×g離心10 min收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌3 次后重懸于模擬胃液中，調(diào)節(jié)菌懸液濃度為109CFU/mL。將菌株置于37 ℃條件下培養(yǎng)，分別于0、1、2、3 h后取出進(jìn)行平板計數(shù)。將1 mL胃液處理3 h后的菌株離心后重懸至模擬腸液中，置于37 ℃條件下培養(yǎng)，分別于2、4、6 h后取出進(jìn)行平板計數(shù)[23]。

1.3.2.4 菌株耐藥性

采用紙片擴(kuò)散法（K-B法）對菌株進(jìn)行20 種抗生素藥敏實驗。取100 μL濃度為107～108CFU/mL的菌懸液，使用滅菌棉簽將其均勻涂布于MRS平板，待其表面干燥后將藥片貼上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察抑菌結(jié)果，檢測抑菌圈直徑，每種抗生素藥片做3 個平行，實驗結(jié)果參照CLSI 2012抗微生物藥物敏感性實驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3 復(fù)合發(fā)酵菌種復(fù)配

依照益生實驗結(jié)果，將7 株乳酸菌按酸化能力、產(chǎn)香性能、改善質(zhì)構(gòu)性能、益生性能進(jìn)行分組，每4 株菌組合進(jìn)行復(fù)配發(fā)酵，并通過分析對比，選出最優(yōu)的菌株組合方式。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

實驗數(shù)據(jù)處理采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，所有實驗重復(fù)3 次，結(jié)果以±s表示，顯著性分析使用Duncan檢驗（P＜0.05，差異顯著）；使用Origin 9.1軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株發(fā)酵特性分析

2.1.1 酸化能力

表2 乳酸菌發(fā)酵性能初篩Table 2 Fermentation performance of LAB strains

酸化能力較強(qiáng)的菌株會導(dǎo)致酸乳過度酸化失去食用價值，酸化能力較弱會影響酸乳中風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生，也易使酸乳感染雜菌。研究表明，消費(fèi)者能夠接受酸乳酸度為70～110 °T[24]。由表2可以看出，大部分株菌的酸度在70～90 °T，產(chǎn)酸能力適中，滿足生產(chǎn)需求。在酸乳生產(chǎn)過程中，如果凝乳時間太短，不利于酸乳香味的生成，也會對酸乳的組織狀態(tài)產(chǎn)生影響；凝乳時間過長，雖然對狀態(tài)和香味有一定作用，但不利于節(jié)約生產(chǎn)能源和時間，也易造成發(fā)酵過程中的雜菌污染[25]。由表2可以看出，菌株的凝乳時間均不大于14 h，其中菌株BSTS6-4和菌株XKN1-5凝乳時間較快，8 h左右即可凝乳，凝乳時間較其他菌株短。

2.1.2 感官評價

由7 株乳酸菌發(fā)酵制成的酸乳的感官評分見表2。7 株菌發(fā)酵所得酸乳色澤較為良好，均呈現(xiàn)乳白色或微黃色；除菌株BST2-3因產(chǎn)酸不足導(dǎo)致的酸乳風(fēng)味不佳外，其余菌株均具有酸乳特有的風(fēng)味且無苦澀味；菌株BSTS6-1、BSTS6-3、BSTS6-4、XSXN1-1、XSXN1-2發(fā)酵制得的酸乳質(zhì)地細(xì)膩、表面光滑和無裂縫，菌株BST2-3發(fā)酵制得的酸乳有輕微的分層現(xiàn)象，可能與其酸化能力弱，凝乳不充分的原因有關(guān)，XKN1-5發(fā)酵制得的酸乳有輕微的乳清析出。

2.1.3 單菌株發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性分析

通過比較各個酸乳樣品的硬度、黏附性、彈性、內(nèi)聚性、膠黏性、保水率以及表觀黏度評估發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)特性，量化比較各項物性指標(biāo)的差異性。由表3可以看出，各菌株酸乳在質(zhì)構(gòu)特性上存在差異（P＜0.05），其中硬度、黏附性、保水率、表觀黏度受發(fā)酵菌株的影響較大。菌株BSTS6-3、XSXN1-2發(fā)酵制得的酸乳大部分物性指標(biāo)較其他幾株菌好，其中菌株BSTS6-3的表觀黏度達(dá)到了3.50 Pa·s，保水率達(dá)55.23%；菌株XSXN1-2的表觀黏度達(dá)到了3.80 Pa·s，保水率達(dá)58.51%。劉娜等[26]對酸羊奶、酸牛奶分離出的保加利亞乳桿菌MAU40167進(jìn)行研究，結(jié)果顯示其保水率達(dá)58.24%，黏度為0.96 Pa·s。Wang Jicheng等[27]研究表明L.caseiZhang發(fā)酵所得酸乳的保水率為60%，表觀黏度為3.96 Pa·s。說明菌株具有商業(yè)應(yīng)用潛力。

表3 單菌株發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性Table 3Texture characteristics of milk fermented by single-strain cultures

2.1.4 菌株產(chǎn)香特性分析

乙醛和雙乙酰是構(gòu)成酸乳典型風(fēng)味的重要化合物，其含量以及兩者之間比例會對酸乳風(fēng)味產(chǎn)生較大的影響[28]，由圖1可以看出，大部分菌株乙醛質(zhì)量濃度大于10 mg/L，乙醛是酸乳主要的風(fēng)味物質(zhì)，其含量對酸乳風(fēng)味的影響較大，要使酸奶達(dá)到良好的風(fēng)味，乙醛質(zhì)量濃度應(yīng)該在10～15 μg/mL之間[29]；有研究表明乙醛與雙乙酰含量比值大于3∶1時，酸乳的風(fēng)味最佳[30]。由圖1可知，各組發(fā)酵乳乙醛和雙乙酰含量之比均大于3∶1，尤其菌株BSTS6-1、XSXN1-1雙乙酰及乙醛產(chǎn)量均較其他菌株高，產(chǎn)香能力突出，其中菌株XSXN1-1的乙醛質(zhì)量濃度可達(dá)16 mg/L，雙乙酰質(zhì)量濃度達(dá)到2.02 mg/L。

圖1 單菌株產(chǎn)香性能Fig.1 Aroma-producing ability of single-strain cultures

2.2 菌株益生特性分析

2.2.1 菌株抑制腸道病原菌特性

由表4可以看出，7 株乳酸菌都對大腸埃希氏菌均具有較好的抑制性，其中桿菌抑菌效果明顯優(yōu)于球菌。有研究表明，引起細(xì)菌性腹瀉的致病菌主要為大腸埃希氏菌，郭利敏等[31]收集分析了463 名腹瀉患者的糞便樣品，得出引起腹瀉的主要原因為致瀉大腸埃希氏菌感染；李迎慧等[32]對深圳市腹瀉人群進(jìn)行調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致該地區(qū)人群腹瀉的主要致病菌為致瀉大腸埃希氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌。本研究菌株BSTS6-4、BSTS6-3、BSTS6-1、BST2-3的發(fā)酵上清液對7 種常見腸道致病菌均有不同程度的抑制作用，抑菌譜較廣，可能是菌株在生長代謝過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸、過氧化氫及細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)，能有效地抑制這些腸道致病菌的生長，從而使得這些乳酸菌在開發(fā)治療腹瀉的藥物中具有應(yīng)用的潛力[33]。

表4 不同菌株抑菌特性Table 4 Antibacterial properties of seven different strains

2.2.2 模擬胃腸液耐受性

益生菌需經(jīng)過胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)才能到達(dá)腸道發(fā)揮益生作用，因此，益生菌菌株必須克服苛刻的消化道環(huán)境，例如胃酸以及腸道中的膽汁和消化酶[34]。本實驗通過體外模擬胃腸道環(huán)境對7 株乳酸菌的胃腸液耐受性進(jìn)行分析，結(jié)果見表5。可以看出7 株乳酸菌均可以耐受模擬胃液，只是在耐受程度上有差異（P＜0.05），其中菌株BSTS6-1、XKN1-5、BST2-3、XSXN1-1在3 h的模擬胃液處理后的存活率高達(dá)89%以上；模擬腸液實驗中，7 株乳酸菌對胃液也表現(xiàn)出不同程度的耐受性（P＜0.05），其中菌株BSTS6-1、BSTS6-3、BSTS6-4耐受腸液能力較差，在模擬腸液中連續(xù)處理6 h后存活率均較低。菌株BST2-3耐受腸液能力最佳，6 h模擬腸液處理后存活率仍達(dá)77.1%，活菌數(shù)高于106CFU/mL，符合乳酸菌應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中的最低要求。

表5 不同菌株在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的耐受性Table 5 Gastrointestinal transit tolerance of seven different strains

2.2.3 黏附性

圖2 不同菌株疏水性Fig.2 Hydrophobicity of different strains

細(xì)菌表面疏水性和自聚集能力作為乳酸菌的表面特性，被用于間接評估益生菌的黏附能力[35]。菌體表面疏水性是影響乳酸菌黏附性典型的內(nèi)在因素，近年來普遍地作為評價乳酸菌黏附性能的重要參數(shù)[36]。由圖2可以看出，所有菌株均表現(xiàn)出一定的疏水性，不同菌株的疏水性存在差異（P＜0.05）。乙酸乙酯是單堿性溶劑，屬于電子供體，氯仿是酸性溶劑，屬于電子受體，供試的7 株乳酸菌對氯仿的疏水性都明顯的高于對乙酸乙酯的疏水性，說明這幾株菌都是電子供體；二甲苯為非極性溶劑，7 株乳酸菌均表現(xiàn)出對二甲苯的黏附性（＞50%），表明這些菌株的細(xì)胞表面都具有疏水性。

菌株的自凝集是指同一種菌株間相互凝集形成多細(xì)胞簇的現(xiàn)象，有研究證明細(xì)胞表面疏水性和自聚集的體外實驗可用于初步篩選適合商業(yè)應(yīng)用的潛在黏附細(xì)菌[37]。由表6可以看出，在5 h的靜置過程中，7 株乳酸菌的自凝集率隨著時間延長而增大，其中菌株BSTS6-4、BSTS6-1、BST2-3的自凝集能力較強(qiáng)，自凝集率可達(dá)50%以上，具有較好的自凝集能力，進(jìn)一步證明這些菌株可以黏附于胃腸道，發(fā)揮其益生特性，有作為益生菌應(yīng)用于食品工業(yè)的潛力。

表6 不同菌株自凝集率Table 6Self-aggregation characteristics of seven different strains%

2.2.4 菌株耐藥性分析

腸道微生物可以通過自發(fā)突變或通過腸道或結(jié)腸內(nèi)的其他物種的水平轉(zhuǎn)移獲得抗性基因，產(chǎn)生抗生素抗性[38]。盡管乳酸菌被認(rèn)為是安全的菌株，但是對于所選定的菌株還是要通過評估其傳播和接受抗生素基因的能力評估其安全性。

圖3 基于抑菌圈直徑對7 株乳酸菌的抗生素抗性熱圖分析Fig.3 Heatmap of antibiotic resistance of 7 strains of LAB based on diameter of inhibition zone

熱圖可以通過顏色梯度表示7 株乳酸菌抗生素抑菌圈的大小，進(jìn)而直觀顯示出7 株乳酸菌的抗生素耐藥性，顏色有紅色漸變?yōu)榉奂t色、白色、綠色，代表抑菌圈直徑的不斷縮小。由圖3可以看出，綠色區(qū)域主要集中在環(huán)丙沙星、諾氟沙星、卡那霉素、多黏霉素、阿米卡星這5 種抗生素中，表示大多數(shù)菌株對這5 種抗生素表現(xiàn)出耐藥性，有研究報道乳酸菌對大多數(shù)核酸抑制劑耐藥，其耐藥機(jī)制主要受乳酸菌存在的藥物外排系統(tǒng)、甲基轉(zhuǎn)移酶以及產(chǎn)生的藥物滅活酶所介導(dǎo)[39]。本研究中卡那霉素、多黏霉素、阿米卡星均屬于氨基糖苷類抗生素，表明本實驗研究結(jié)果與之前報道較一致。圖中大部分區(qū)域的顏色位于紅色和綠色的漸變區(qū)域，表明7 株乳酸菌對大部分抗生素敏感。從熱圖縱向分析，大部分菌株對于頭孢噻肟、四環(huán)素、米諾環(huán)素、利福平、氯霉素、紅霉素、羥氨芐青霉素、青霉素、氨芐西林、克林霉素、鏈霉素、萬古霉素、苯唑西林、慶大霉素表現(xiàn)出敏感；從橫向分析，菌株BST2-3所對應(yīng)區(qū)域顏色介于紅色與綠色之間的漸變區(qū)域，表明對20 種實驗用抗生素藥片均表現(xiàn)出敏感，即菌株安全性較高，這可能與樣品的采集地有關(guān)，新疆伊犁自治州是我國主要的畜牧業(yè)基地之一，該地區(qū)的少數(shù)民族經(jīng)常手工制作各種發(fā)酵乳制品，極少使用抗生素，因此有很多天然益生菌資源值得開發(fā)。

2.3 最優(yōu)組合菌株篩選

2.3.1 菌株組合方式

單菌株的發(fā)酵和益生實驗研究中，酸化能力較優(yōu)的菌株為XKN1-5和BSTS6-4，能顯著改善酸乳質(zhì)構(gòu)的菌株為BSTS6-3和XSXN1-2，產(chǎn)香能力較為突出的菌株為BSTS6-1和XSXN1-1，益生特性較為突出的菌株為BST2-3，依照酸化、產(chǎn)香、質(zhì)構(gòu)以及益生實驗結(jié)果將7 株乳酸菌分為4 組進(jìn)行組合復(fù)配，共得到8 種組合，如表7所示。按照1∶1∶1∶1的菌種接種比例進(jìn)行發(fā)酵，選擇其中最優(yōu)的復(fù)合發(fā)酵菌株的組合方案。

表7 復(fù)合發(fā)酵菌株組合方案Table 7Combinations of seven strains for mixed-culture fermentation

2.3.2 菌株組合方式對酸奶品質(zhì)的影響

不同菌株組合方式對酸乳總酸度、風(fēng)味物質(zhì)、凝乳時間以及感官評價等的影響見表8。8 組樣品的酸度均控制在70～110 °T，符合國家規(guī)定的酸乳酸度要求；8 組樣品的風(fēng)味物質(zhì)含量均處于較高水平，其中以5號組合最為突出，發(fā)酵乳中雙乙酰質(zhì)量濃度達(dá)7.96 mg/L，乙醛質(zhì)量濃度達(dá)28.68 mg/L；8 組樣品的凝乳時間均控制在5.5 h左右，凝乳時間較短，節(jié)省成本；8 組酸乳樣品的感官評分均較單菌株發(fā)酵酸乳高，表明復(fù)合發(fā)酵在一定程度上提升了酸乳的品質(zhì)，其中5號組合復(fù)合發(fā)酵制得的酸乳樣品組織細(xì)膩、口感順滑、酸甜適中且具有酸牛乳獨(dú)有的風(fēng)味，受到大多數(shù)評測者的喜愛，感官評分顯著高于其他幾組（P＜0.05）。

表8 菌株組合方式對酸奶發(fā)酵性能的影響Table 8 Effects of different strain combinations on acidity, sensory score and coagulation time of yoghurt

表9 菌種組合方式對發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 9 Texture characteristics of fermented milk with different strain combinations

如表9所示，復(fù)合發(fā)酵制得酸乳的各項質(zhì)構(gòu)指標(biāo)均較單菌株發(fā)酵好，其中5號組合黏附性、膠黏性、保水率以及表觀黏度均較其他幾組好，表現(xiàn)出良好的質(zhì)構(gòu)特性。綜上所述，5號組合方式為復(fù)合發(fā)酵菌株的最佳方案，其菌種組成為L.delbrueckiisubsp.bulgaricus（BSTS6-4和BSTS6-3）、L.lactisXSXN1-1以及L.fermentumBST2-3。使用該混合菌種組合發(fā)酵酸乳，發(fā)酵時間短，發(fā)酵制得酸乳組織狀態(tài)良好，風(fēng)味獨(dú)特，而且還具有一定的益生特性。

3 結(jié) 論

通過發(fā)酵和益生實驗對從新疆伊犁地區(qū)乳品中分離的7 株優(yōu)良乳酸菌進(jìn)行分析研究，以獲得最優(yōu)的復(fù)合發(fā)酵菌株的組合方案。單菌株發(fā)酵實驗中XKN1-5和BSTS6-4酸化能力較強(qiáng)，BSTS6-3和XSXN1-2發(fā)酵所制得的酸奶質(zhì)構(gòu)特性較佳，BSTS6-1和XSXN1-1產(chǎn)香能力突出；益生實驗結(jié)果表明菌株BST2-3在模擬胃腸液處理9 h后活菌數(shù)仍可達(dá)106CFU/mL，滿足了益生菌到達(dá)胃腸道所需的最低活菌數(shù)要求；同時7 株乳酸菌對大部分所試抗生素表現(xiàn)敏感，安全性較好。根據(jù)發(fā)酵和益生實驗結(jié)果將菌株分為4 組，每4 株菌組合進(jìn)行酸乳發(fā)酵，共得到8 種組合方式。將8 組復(fù)合發(fā)酵所得酸乳的各項指標(biāo)進(jìn)行分析對比，結(jié)果顯示，5號組合凝乳時間時間短，產(chǎn)香能力最為突出，保水率、表觀黏度等指標(biāo)均為最優(yōu)，感官評分可達(dá)91.6 分，為最優(yōu)的復(fù)合發(fā)酵菌株組合方案，菌株組成為L.delbrueckiisubsp.bulgaricus（BSTS6-4和BSTS6-3）、S.thermophilusXSXN1-1以及L.fermentumBST2-3，菌種接種比例為1∶1∶1∶1。