鹵湯牛肉貯藏過程中揮發性風味物質分析

李 素，周慧敏，趙 冰，潘曉倩，朱 寧，吳倩蓉，劉 夢，張順亮

（中國肉類食品綜合研究中心，肉類加工技術北京市重點實驗室，北京 100068）

牛肉在人們飲食習慣中占有重要地位，國內傳統食用方法以鹵制為主，通過香辛料及調味料賦予牛肉特有的味道，鹵湯也為日常飲食增加滋味。鹵湯牛肉產品多用于快餐牛肉面的制作，因其方便、營養、美味等特點，在節奏日益加快的現代化生活中，逐漸成為消費主流，而風味是影響其食用品質的重要因素。為提升牛肉制品食用品質，國內外學者開展了多項研究。Conroy[1]及Fellendorf[2]等研究了低鈉鹽或鈉鹽替代物對牛肉產品食用品質的影響。Lepper-Blilie等[3]研究了烤肉大小、烹調方法和加熱過程對防止牛肉塊在烘烤中的過熱風味形成的影響。國外學者對牛排類產品研究也較多，Legako等[4]開展了烹調方法對牛排脂肪酸含量及中性和極性脂組分含量的影響，提出了極性脂的氧化在牛肉風味的形成中起很大的作用。Fatih等[5]研究烤肉種類和烹調水平對牛排中雜環芳香胺和多環芳烴生成的影響。有學者研究牛的種類、飼養條件、屠宰工藝等對牛排中脂肪酸變化及其對風味物質的影響[6-7]。Gong Hui等[8]發現煮制4 h辣味鹵牛肉風味最豐富。國內學者在鹵牛肉及鹵湯相關品質保持技術方面有一定研究[9-11]，黃名正等[12]研究添加不同NaCl對燉煮牛肉揮發性風味成分的影響；唐春紅等[13]研究了反復鹵煮對老湯的品質影響；也有學者在腌制用水量、加工過程等方面對醬牛肉風味影響進行了研究[14-15]，但鮮見有關鹵湯牛肉在貯藏期間牛肉及鹵湯的風味物質變化研究，牛肉在有鹵湯存在的情況下保存，其食用品質會發生一定變化，包括質地、色澤、風味等品質變化，因此，探究鹵湯牛肉貯藏期間風味品質變化對該類產品品質保持有重要作用。

國內外學者從食品等物質中鑒定出多種揮發性化合物，并研究了該類物質的嗅覺閾值，可根據判定的嗅覺閾值，采用氣味活度值（odor activity value，OAV）進行風味貢獻率的評價[16]。氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用技術常用于揮發性風味物質檢測，將GC-MS聯用技術結合OAV分析可精確判斷對樣品有主要貢獻的風味成分。目前，對于鹵湯牛肉制品在貯藏期間其牛肉及肉湯的風味分析鮮見報道，本實驗采用吹掃/捕集-熱脫附進行風味物質吸附前處理，借助GC-MS技術及OAV分析方法研究鹵湯牛肉在貯藏期間牛肉及鹵湯的揮發性風味物質的變化，為提升鹵湯牛肉貯藏期間食用品質及生產加工改善提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹵湯牛肉 北京李先生加州牛肉面大王有限公司；2-甲基-3-庚酮、C6～C25系列正構烷烴（均為色譜純）美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

SCIENTZ-11L型均質機 寧波新芝生物科技股份有限公司；TRACE 1310 GC-TSQ 8000 MS聯用儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Tenax TA石英玻璃吸附管、Gerstel TDS半自動熱脫附進樣器、ODP2嗅聞檢測儀德國Gerstel公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品準備

鹵湯牛肉中，牛肉約為3 cm×3 cm×3 cm肉塊，每包產品含肉約55 g，鹵湯約400 g，采用110 ℃、30 min殺菌條件，成品完成后取足量樣品運輸至實驗室在25 ℃、相對濕度50%的恒溫恒濕箱中貯藏，以樣品運輸至實驗室時間為初始取樣點，貯藏期間每2 個月取樣一次進行測定，根據樣品的氣味及色澤等感官品質確定以貯藏0、2、4、6 月和8 月為實驗取樣點，對樣品中牛肉及肉湯的揮發性風味物質分別進行測定，分別編號為R0、R2、R4、R6、R8與T0、T2、T4、T6、T8。

1.3.2 樣品風味物質捕集及熱脫附處理

鹵湯牛肉在不同貯藏節點每次取3 包樣品，將牛肉與湯分離，牛肉用均質機在相同條件下粉碎后準確稱取10.0 g于吹掃/捕集制樣瓶中，鹵湯直接稱取10.0 g于吹掃/捕集制樣瓶中，參考文獻[8]中方法進行實驗，牛肉與湯各平行測定3 次取平均值。

1.3.3 GC-MS檢測

1.3.3.1 GC-MS進樣條件

GC條件：使用TG-Wax MS極性色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：進樣口溫度250 ℃，初始柱溫40 ℃，維持時間2 min，再以4 ℃/min升溫至200 ℃，維持1 min，以8 ℃/min升溫至220 ℃，維持5 min。載氣：氦氣（純度＞99.99%），流速1.0 mL/min維持2 min，不分流。

MS條件：電子電離源；接口溫度260 ℃；傳輸線溫度240 ℃；電壓1.2 kV；質量掃描范圍m/z40～600，全掃描模式，掃描時間2 s；離子源溫度260 ℃；電子能量70 eV。

1.3.3.2 揮發性風味物質定性定量分析

定性：采集數據對照美國國家標準與技術研究所與Willey譜庫進行檢索，選取正反相似度指數均大于800的化合物分析；通過C6～C25的正構烷烴標準物，按式（1）計算測定物質的保留指數[17]（retention index，RI）：

式中：tx、tn、tn＋1分別為樣品、正構烷烴Cn、正構烷烴Cn＋1的保留時間/min。

定量：根據已知內標2-甲基-3庚酮的含量，依據化合物的峰面積比值與含量呈正比的原理，對揮發性風味物質進行定量分析，按式（2）計算：

式中：C為測定物質的含量/（μg/kg）；Ax為測定物質的峰面積；C0為內標物質量濃度/（μg/μL）；V為內標物進樣體積/μL；A0為添加的內標物峰面積；m為測定樣品質量/g。

1.3.4 OAV計算

OAV是風味物質的質量濃度與其閾值的比值，按式（3）計算：

式中：C為測定揮發性化合物的含量/（μg/kg）；T為相同物質在水介質中的嗅覺閾值/（μg/kg）。

1.4 數據處理

利用SPSS Statistics 21.0對數據進行平均值、標準偏差計算及顯著性差異分析，P＜0.05，差異顯著，利用UnscramblerX 10.1進行主成分分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 樣品貯藏期間揮發性風味物質變化規律

表1 貯藏期間牛肉中揮發性風味物質含量Table 1 Concentrations of volatile flavor compounds from stewed beef samples during storage

續表1

由表1～3與圖1可知，鹵湯牛肉樣品在貯藏過程中從牛肉中分別檢測出46、50、42、44、41 種物質，總含量分別為2 537.62、4 505.18、5 380.24、4 149.90、1 677.10 μg/kg；肉湯中分別檢測出50、40、48、47、38 種物質，總含量分別為3 840.15、3 877.84、1 236.24、1 003.36、833.18 μg/kg。鹵湯牛肉樣品貯藏過程中，牛肉中風味物質呈先上升后下降的趨勢，0、2、4 月樣品風味物質逐漸增加，且差異顯著（P＜0.05），6 月牛肉樣品風味物質開始降低，與2 月樣品差異不顯著，與貯藏時間差異顯著，貯藏至8 月，牛肉樣品中風味物質顯著低于其他組別。肉湯中揮發性風味物質含量呈逐漸降低趨勢，0 月與2 月肉湯中揮發性風味物質總含量無顯著差異，貯藏至4 月，風味物質含量顯著降低，4 月及8 月肉湯樣品間揮發性風味物質總含量無顯著差異。牛肉樣品中醇類、醛類物質占比例較高，其次是其他類及碳氫化合物；肉湯樣品中醇類、醛類物質占比較高，其余幾種物質占比較低。

表2 貯藏期間肉湯中揮發性風味物質含量Table 2 Concentrations of volatile flavor compounds from broth samples during storage

表3 貯藏期間樣品中揮發性風味物質含量及數量Table 3 Kinds and contents of volatile compounds identified in samples during storage

圖1 貯藏期間牛肉（A）和肉湯（B）樣品風味物質占比Fig.1 Proportions of various classes of volatile flavor compounds in stewed beef samples (A) and broth samples (B) during storage

2.2 樣品貯藏期間揮發性風味物質分析

2.2.1 碳氫化合物分析

不同貯藏期間牛肉樣品中分別檢測出12、10、12、12、10 種碳氫化合物，肉湯種檢測出12、8、10、10、8 種。碳氫化合物在牛肉中總含量呈先上升后下降的趨勢，肉湯中呈逐漸降低的趨勢，牛肉中檢測出碳氫化合物含量明顯高于肉湯中此類物質含量。碳氫化合物的形成與脂肪酸烷氧自由基均裂有關[18]，大多含量低、覺察閾值高，對風味貢獻不明顯，但是有助于提高肉的整體風味。某些飽和烴類物質出現先上升后降低現象，可能由于此類化合物是雜環化合物形成中間體[19]，在貯藏過程中發生了成分轉化；貯藏過程中一些烯烴類化合物未全部檢測到，可能是由于雙鍵不穩定發生了氧化反應[20]，使其含量低于檢出限。牛肉及肉湯中D-檸檬烯含量較高，有類似柑橘及檸檬的香氣，一般來源于香辛料。

2.2.2 醇類物質分析

貯藏期間鹵湯牛肉樣品中醇類物質是主要成分，主要來自脂肪氧化、醛的還原及香辛料[21]，牛肉中分別檢測出10、12、10、11、11 種，肉湯中檢測出14、11、13、15、12 種，醇類物質在牛肉及肉湯中均呈先上升后降低的趨勢。從表2、3可知，芳樟醇、松油烯-4-醇、α-松油醇含量較高，可提供類似花香、肉豆蔻及薄荷的香氣，是八角、肉桂中常見揮發性風味成分[22]，可為肉類產品提供良好風味，芳樟醇在醬牛肉中也是最重要的風味物質之一[14]。肉湯中1-十二醇含量較高，具有持久的油脂氣味，可能由不飽和脂肪酸氧化形成[23]。

2.2.3 醛類物質分析

貯藏期間從鹵湯牛肉樣品的牛肉中分別檢測出13、14、13、12、11 種醛類物質，肉湯中為11、9、11、9、7 種。醛類物質是形成肉制品風味的重要物質，從表3可看出，牛肉中醛類物質含量呈先上升后降低的趨勢，4 月時樣品中醛類物質含量最高，結合表2可發現此時形成了大量的壬醛及苯甲醛，壬醛為油酸的氧化產物[24]，是鹵制類牛肉中代表性風味物質[25]，苯甲醛則是苯丙氨酸的降解產物[26]，說明貯藏至4 月牛肉發生了較大程度脂肪氧化及氨基酸降解。肉湯中醛類物質在0 月及2 月含量較高，4 月時總量顯著降低，其中，壬醛、苯甲醛及對茴香醛含量顯著降低，茴香醛主要來自香辛料，其含量降低可能是發生較嚴重逸失，壬醛、苯甲醛降低說明肉湯在加工過程中已經發生脂肪氧化作用，隨貯藏時間延長，此類物質逐漸分解或轉化。

2.2.4 酮類、酯類及其他類物質分析

鹵湯牛肉樣品中檢測出酮類物質及酯類物質含量較低，貯藏期間兩類物質均呈逐漸降低趨勢，且肉湯中酮類及酯類物質的含量高于牛肉中的含量。酮類化合物一般由不飽和脂肪酸氧化、脫羧基作用形成，部分酮類物質來源于香辛料，對肉類整體風味有重要作用[27-28]。酯類物質可能由醛類物質氧化形成的酸類與醇類經酯化反應形成，也可能加入了酒類調味物質[29]。牛肉中及肉湯中均檢測出4-烯丙基苯甲醚，該物質呈類似甘草、茴芹的味道，可賦予產品愉悅的香氣，在牛肉樣品中含量較高，肉湯中含量較低，可能源于八角、茴香、小茴香等香辛料[30]，且在肉塊上大量附著。樣品中檢測出3 種雜環類含氮化合物，分別為2,6-二甲基吡嗪、苯并噻唑及2-乙?；量祟愇镔|閾值低，對肉制品風味貢獻大，牛肉中含氮化合物貯藏至4 月即未檢出，肉湯中此類物質保持時間則較長。

2.3 樣品OAV分析及主成分分析

根據所選取閾值[16]計算OAV大于1的揮發性風味物質，一般OAV越大，該物質對產品風味貢獻越大。貯藏期間，從鹵湯牛肉樣品的牛肉及肉湯中分別檢測出19、18、19、18、16 種及14、10、17、13、10 種對風味貢獻較大的物質，醛類物質種類最多，牛肉中主要風味貢獻物質種類多于肉湯，香葉醇、3-甲基丁醛、十四醛僅在牛肉中有重要貢獻，乙酸異戊酯僅在0 月的牛肉樣品中有重要貢獻，十二烷醛僅在肉湯中有貢獻。隨貯藏時間延長，總OAV呈先上升后降低的趨勢，牛肉樣品4 月時總OAV（732.80）最高，肉湯中2 月時總OAV（454.06）最高。整體來看芳樟醇OAV最高，其次是壬醛、辛醛、對茴香醛，是形成鹵湯牛肉的主要風味貢獻物質，與前期工作中[14]對醬牛肉主要風味貢獻物質的研究結果接近。

表4 不同鹵湯牛肉樣品揮發性風味物質OVATable 4 OAVs of volatile compounds in stewed beef with broth samples

采用主成分分析法對表4中OAV大于1的主要風味貢獻物質進行分析，如圖2所示。第1主成分貢獻率為91%，第2主成分貢獻率為6%，累計貢獻率為97%。由圖2A可看出，第1主成分主要貢獻物質為芳樟醇，其次為壬醛及辛醛，第2主成分主要貢獻物質為壬醛，其次為辛醛及對茴香醛，與OAV分析結果一致。從圖2B可看出，鹵湯牛肉樣品的牛肉及肉湯中主要揮發性風味物質分布較為隨機，主要在第1主成分上有差異，說明同一鹵湯牛肉樣品中肉湯及牛肉的風味物質隨貯藏時間延長變化規律并非一致，與2.1節中分析結果一致。

圖2 主成分分析載荷圖（A）和得分圖（B）Fig.2 Correlation loading plot (A) and score plot of PCA (B)

3 結 論

通過對貯藏期間鹵湯牛肉樣品中的牛肉及肉湯分別進行揮發性風味物質分析可知，隨貯藏時間逐漸延長，鹵湯牛肉樣品中牛肉與肉湯的揮發性風味物質變化規律不同。牛肉樣品揮發性風味物質總含量呈先上升后降低的趨勢，貯藏4 月時總含量最高，8 月時最低，貯藏期間醇類、醛類物質占比例較高；肉湯中揮發性風味物質總含量基本呈逐漸降低趨勢，0 月時含量高于牛肉中總含量，貯藏期間醇類、醛類物質占比較高。通過OAV分析發現醛類物質是主要風味貢獻物質，牛肉中主要風味貢獻物質種類與OAV高于肉湯，隨貯藏時間延長，總OAV呈先上升后降低的趨勢，牛肉樣品4 月時總OAV（732.80）最高，肉湯中2 月時總OAV（454.06）最高，結合主成分分析發現不同組樣品主要在第1主成分的貢獻率有差異，壬醛、辛醛、對茴香醛是鹵湯牛肉的主要風味貢獻物質。