SPME-GC-MS和GC-O鑒定3 種不同生產(chǎn)工藝馬蘇里拉奶酪的特征香氣物質(zhì)

王 姣，許凌云，張晉華，邊 冉，王 蓓,2,，曹雁平,2

（1.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048；2.北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048）

馬蘇里拉奶酪具有特有的彈性與韌性，它是我國(guó)僅次于切達(dá)奶酪進(jìn)口量的奶酪種類之一[1]?，F(xiàn)在市面上銷售的馬蘇里拉奶酪由于選用的原料乳來(lái)源不同且生產(chǎn)工藝不同，大致可以分為三大類：新鮮水牛奶馬蘇里拉奶酪、新鮮牛奶馬蘇里拉奶酪和半硬質(zhì)牛奶馬蘇里拉奶酪。由于水牛奶本身的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較牛奶而言更豐富，其脂肪、蛋白質(zhì)、總固形物、非脂乳固體含量和乳糖含量均高于牛奶[2]，因此水牛奶馬蘇里拉奶酪的品質(zhì)較高，但也更易發(fā)生摻假現(xiàn)象，因而對(duì)不同類型的馬蘇里拉奶酪進(jìn)行識(shí)別檢測(cè)對(duì)于我國(guó)進(jìn)口奶酪制品品質(zhì)控制具有重要意義。現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外對(duì)馬蘇里拉奶酪的研究大多集中在奶酪生產(chǎn)的影響因素[3]、微觀結(jié)構(gòu)和包裝[4]與貯藏等方面[5]，很少有文獻(xiàn)對(duì)不同類別馬蘇里拉的揮發(fā)性風(fēng)味組分進(jìn)行研究[6]。

近年來(lái)，固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）聯(lián)用和氣相色譜-嗅覺(jué)（gas chromatography-olfactometry，GC-O）測(cè)量技術(shù)廣泛用于各種食品的香氣化合物分析。冒德壽等[7]利用SPMEGC-MS結(jié)合GC-O鑒定清香型白酒特征性香氣物質(zhì)，劉盼盼等[8]利用SPME-GC-MS和香氣活力值（odor activity values，OAV）研究不同產(chǎn)地綠茶飲料揮發(fā)性風(fēng)味成分物質(zhì)含量及構(gòu)成差異。本實(shí)驗(yàn)采用SPME-GC-MS、GC-O結(jié)合OAV對(duì)三大類馬蘇里拉奶酪的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，并在其基礎(chǔ)上結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步主成分分析，為不同種類馬蘇里拉奶酪的風(fēng)味研究提供理論基礎(chǔ)，也為馬蘇里拉奶酪摻假的檢測(cè)和鑒別提供進(jìn)一步的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬蘇里拉奶酪樣品采集于北京婕妮路進(jìn)口超市，其產(chǎn)地信息及主要成分見(jiàn)表1。根據(jù)其制備工藝及原料乳的不同可將馬蘇里拉奶酪樣品分為三大類[9]。不同馬蘇里拉奶酪制備工藝流程[10]見(jiàn)圖1。

正構(gòu)烷烴（C7～C40，色譜純） 美國(guó)O2si公司；氦氣（純度99.999%） 北京天利仁和物資貿(mào)易有限責(zé)任公司。

表1 馬蘇里拉奶酪的產(chǎn)品信息Table 1 Information about Mozzarella cheeses tested in this study

圖1 馬蘇里拉奶酪的工藝流程Fig.1 Flow chart of Mozzarella cheese processing

1.2 儀器與設(shè)備

7890 B-5977A型GC-MS聯(lián)用儀、DB-WAX型毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國(guó)Agilent公司；7890B-ODP3 GC-O儀 德國(guó)Gerstel公司；HH-1型超級(jí)恒溫水浴鍋 金壇市至翔科教儀器廠；SPME裝置的手柄、固定搭載裝置及50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國(guó)Supelco公司；ScilogexMX-E旋渦混勻儀美國(guó)賽洛捷克公司。

1.3 方法

1.3.1 SPME

取6 g奶酪樣品置于容器中，用高速分散器將其打碎，并將其和1 μL內(nèi)標(biāo)0.816 mg/mL的2-甲基-3-庚酮及0.931 mg/mL的2-甲基戊酸用旋渦混勻儀混勻30 min，充分混合后混合物放入40 mL頂空瓶中。最后將混合的待吸附樣品在60 ℃水浴中平衡30 min，然后將已經(jīng)老化好的萃取頭插入頂空瓶中進(jìn)行萃取，吸附時(shí)間30 min，等待GC進(jìn)樣。

1.3.2 GC-O-MS測(cè)定

GC條件：解吸時(shí)間5 min，氦氣作載氣，流速1.2 mL/min；DB-WAX毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持4 min，以8 ℃/min升到100 ℃，保持2 min，然后以5 ℃/min升溫到180 ℃，最后以10 ℃/min升溫到230 ℃，保持5 min。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；進(jìn)樣口溫度250 ℃；四極桿溫度150 ℃；掃描模式為全掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z20～350；為防止嗅聞時(shí)鼻腔干燥，加濕空氣到嗅聞口。每種樣品做3 次平行。

1.3.3 定性定量分析

采用3 種方法對(duì)化合物定性：首先在NIST 14譜庫(kù)中進(jìn)行檢索、對(duì)比；計(jì)算化合物的保留指數(shù)（retention index，RI）并與文獻(xiàn)中的RI進(jìn)行對(duì)比；比對(duì)嗅聞結(jié)果。RI的計(jì)算是將正構(gòu)烷烴C7～C40與馬蘇里拉奶酪在相同的色譜條件下得出GC保留時(shí)間，按下式計(jì)算待測(cè)物i的RI（tn＜ti＜tn＋1）：

式中：n為碳原子數(shù)；tn為碳原子數(shù)為n的正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間/min；tn＋1為碳原子數(shù)為n＋1的正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間/min；ti為樣品i的保留時(shí)間/min。

采用內(nèi)標(biāo)半定量的方法計(jì)算各揮發(fā)性成分的含量，根據(jù)化合物及內(nèi)標(biāo)化合物峰面積比值計(jì)算各揮發(fā)性成分的含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

揮發(fā)性化合物主成分分析采用Canoco for Windows 4.5軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬蘇里拉奶酪的化合物定量分析

圖2 6 種馬蘇里拉奶酪的化合物含量對(duì)比圖Fig.2 Contents of volatile compound classes in six brands of Mozzarella cheese

3 類馬蘇里拉奶酪共檢測(cè)出109 種揮發(fā)性風(fēng)味成分，見(jiàn)表2。其中酯類和酸類化合物種類最多有20 種，其次是醇類、醛類分別為17、15 種，此外還包括酮類、烯烴類、芳香及雜環(huán)類以及含硫類化合物等。不同工藝制備的馬蘇里拉奶酪的揮發(fā)性化合物種類和含量差別較大，見(jiàn)圖2。新鮮水牛奶奶酪以酸類為主，其次是酯類和醛類；新鮮牛奶奶酪中酸類化合物含量較高，內(nèi)酯類化合物和芳香及雜環(huán)類化合物含量也較高；半硬質(zhì)牛奶奶酪以酸類化合物為主，其次是芳香及雜環(huán)類化合物、內(nèi)酯類和含硫化合物。由于風(fēng)味組分對(duì)樣品的風(fēng)味貢獻(xiàn)程度不僅取決于化合物含量的高低[11]，還與其對(duì)應(yīng)的閾值有關(guān)，為了更好地對(duì)不同種類馬蘇里拉奶酪風(fēng)味組分的貢獻(xiàn)情況進(jìn)行評(píng)定，結(jié)合文獻(xiàn)閾值結(jié)果對(duì)嗅聞得到的31 種化合物的香氣值進(jìn)行進(jìn)一步分析。

表2 6 種不同品牌馬蘇里拉奶酪的化合物定量結(jié)果Table 2 Quantitative results of volatile components in six different brands of Mozzarella cheese

續(xù)表2

續(xù)表2

2.2 馬蘇里拉奶酪中主要香氣化合物組分的OAV分析

表3 馬蘇里拉奶酪中31種化合物的OAVTable 3 OAV of 31 compounds in Mozzarella cheese

馬蘇里拉奶酪中香氣組分OAV的計(jì)算是基于文獻(xiàn)中已有的閾值，如表3所示，其中OAV大于1的化合物有乙酸、丁酸、己酸、辛酸、正癸酸、乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、δ-癸內(nèi)酯、δ-十二內(nèi)酯、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、糠醛、(E)-2-壬烯醛、苯乙醛、1-辛烯-3-醇和2-十一酮，共20 種風(fēng)味化合物，其中己酸乙酯的OAV高達(dá)99.28，說(shuō)明對(duì)馬蘇里拉奶酪整體風(fēng)味的形成起關(guān)鍵貢獻(xiàn)作用。

脂肪酸類化合物對(duì)馬蘇里拉奶酪的風(fēng)味具有重要影響，其本身不僅是奶酪的主要風(fēng)味物質(zhì)，還是其他風(fēng)味物質(zhì)（如甲基酮、醇、酯等風(fēng)味物質(zhì)）的前體[22]。OAV大于1的脂肪酸類化合物有丁酸、己酸、辛酸、乙酸、癸酸，這5 種揮發(fā)性較強(qiáng)的中、短碳鏈脂肪酸，它們是牛奶中的特征風(fēng)味組分，在低質(zhì)量濃度下均具有較為濃郁的奶香味，其中OAV較大的己酸和辛酸分別帶有強(qiáng)烈的、腐臭奶酪香氣[23]和酸臭味，這些脂肪酸類化合物對(duì)馬蘇里拉奶酪風(fēng)味起到主要貢獻(xiàn)作用。

奶酪中含有豐富的酯類化合物，短鏈的酯類化合物不僅在常溫下?lián)]發(fā)性較強(qiáng)，且具有較低的閾值。這些酯類能夠很好地掩蓋奶酪中脂肪酸和胺類物質(zhì)所產(chǎn)生不愉快的風(fēng)味[24]，且許多酯類能夠賦予奶酪甜味、水果味及花香味，因而對(duì)奶酪感官品質(zhì)具有較好貢獻(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)中OAV大于1的酯類物質(zhì)有4 種，分別為乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯，這類酯類物質(zhì)的混合物被稱為黃油酯[25]，其中己酸乙酯具有菠蘿的香甜味[26]，辛酸乙酯具有柔和、愉快而持久的白蘭地酒香味[27]，是乳制品中特征性風(fēng)味組分。內(nèi)酯類化合物中δ-癸內(nèi)酯和δ-十二內(nèi)酯的OAV大于1，內(nèi)酯類化合物大多具有奶油、椰子等油脂香氣，在奶酪整體風(fēng)味的構(gòu)建中發(fā)揮著不可替代的作用[28]。

酮類物質(zhì)感知閾值低，是奶酪風(fēng)味組分中不可或缺的一類。其中最重要是具有奶油香氣的甲基酮類化合物。甲基酮類化合物多由不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)生[29]，能夠賦予奶酪奶香味、水果味及花香味。酮類物質(zhì)中僅2-十一酮的OAV大于1,2-十一酮，是重要的牛奶奶香味的來(lái)源[30]，對(duì)馬蘇里拉奶酪的風(fēng)味的形成具有促進(jìn)作用。

醛類組分會(huì)很快還原成醇及相應(yīng)的酸，因而醛類物質(zhì)在奶酪中的存留時(shí)間很短[31]，但醛類組分對(duì)于奶酪的風(fēng)味同樣有重要的影響。OAV大于1的醛類物質(zhì)有己醛、庚醛、辛醛、壬醛、糠醛、(E)-2-壬烯醛和苯乙醛，壬醛有柑橘香、花香[32]，庚醛具有強(qiáng)烈和不愉快的油脂刺鼻氣味[33]，辛醛有類似甜橙的香氣[34]，糠醛具有苦杏仁味，(E)-2-壬稀醛具有黃瓜味和西瓜味，己醛呈現(xiàn)出青草香味[35]，苯乙醛具有蜂蜜、鮮花的香氣[36]，這些醛類物質(zhì)對(duì)馬蘇里拉奶酪的整體風(fēng)味具有積極作用。

醇類物質(zhì)在奶酪中主要有4 種來(lái)源：一是乳糖代謝；二是甲基酮還原；三是氨基酸代謝，氨基酸可通過(guò)Strecker降解產(chǎn)生醇類；四是亞油酸、亞麻酸降解[37]。醇類物質(zhì)中僅有1-辛烯-3-醇的OAV大于1,1-辛烯-3-醇具有濃郁的蘑菇香氣[38]，對(duì)奶酪風(fēng)味的形成起著很好的修飾作用。

綜上可知，脂肪酸類、酯類、內(nèi)酯類、酮類、醛類和醇類物質(zhì)共同構(gòu)建了馬蘇里拉奶酪的整體風(fēng)味。

2.3 主成分分析

選取嗅聞得到的31 種化合物的OAV（表3），對(duì)3 類不同工藝制備的馬蘇里拉奶酪風(fēng)味化合物的OAV進(jìn)行主成分分析，從而對(duì)不同制作工藝的奶酪差異進(jìn)行表征，并進(jìn)一步得到揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對(duì)奶酪差異的貢獻(xiàn)度[39]。

圖3 6 種馬蘇里拉奶酪的特征性風(fēng)味物質(zhì)的主成分分析Fig.3 PCA plot of characteristic flavors of six brands of Mozzarella cheese

如圖3所示，第1、2主成分的貢獻(xiàn)率分別為61.9%、21.4%，總貢獻(xiàn)率大于75%，說(shuō)明這2 個(gè)主成分基本能夠表征樣品的大部分特征[40-41]。6 種馬蘇里拉樣品能夠明顯按各自特性分為3 類，表明采集的數(shù)據(jù)能反映出6 種樣品間的差異。對(duì)喬瓦和奇?zhèn)愅姓w風(fēng)味貢獻(xiàn)較大的化合物為己醛、庚醛、己酸乙酯、(E)-2-壬烯醛、糠醛和丁酸乙酯，對(duì)蒂娜和奧瑞秋整體風(fēng)味影響較大的化合物為1-辛烯-3-醇、2-十一酮和δ-十二內(nèi)酯，對(duì)荷氏和米格整體風(fēng)味起主要作用的化合物為正癸酸、苯乙醛和乙酸乙酯，根據(jù)這些化合物的差異能夠很好地區(qū)分這3 類不同生產(chǎn)工藝的馬蘇里拉奶酪。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)SPME-GC-MS和GC-O對(duì)3 類不同工藝制備的馬蘇里拉奶酪進(jìn)行分析，結(jié)果得出：共檢測(cè)出109 種揮發(fā)性風(fēng)味成分，酯類20 種、酸類20 種、醇類17 種、醛類15 種、酮類12 種、芳香及雜環(huán)類11 種、內(nèi)酯類6 種、烯烴類5 種以及含硫類化合物3 種。其中嗅聞確定的化合物有31 種，將這31 種化合物的OAV進(jìn)行主成分分析，表明新鮮水牛奶馬蘇里拉奶酪的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為己醛、庚醛、己酸乙酯、(E)-2-壬烯醛、糠醛和丁酸乙酯；新鮮牛奶馬蘇里拉奶酪的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為1-辛烯-3-醇、2-十一酮和δ-十二內(nèi)酯；半硬質(zhì)牛奶馬蘇里拉奶酪的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為正癸酸、苯乙醛和乙酸乙酯。主成分檢測(cè)結(jié)果能將這6 種馬蘇里拉奶酪大致分為3 類，說(shuō)明這些揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)能很好地描述不同類別奶酪的風(fēng)味差異。