離子色譜法測定食醋及其制品中有機酸的分析方法

紀鳳娣，夏 蓉，陶匯源，魏 巍，穆曉婷，李 東，魯 緋,

（1.北京市營養源研究所，北京 100069；2.鎮江恒順生物工程有限公司，江蘇 鎮江 212000）

中國傳統食醋[1-2]，即谷物醋，是由大米、小麥、高粱、小米、麩皮等通過微生物發酵釀得[3]，是佐餐和烹飪中常用的一種液體酸味調味料[4]。鎮江香醋、山西陳醋、福建永春老醋和四川保寧醋等[5-6]是中國著名的具有獨特口感特征及感官品質的地理標志保護品牌的食醋。

有機酸是食醋中的一組重要化合物，它們不僅是具有特殊抑菌作用的功能性物質[7-9]，也是能夠影響食醋感官特性的風味物質。有機酸的種類和含量最終影響食醋產品的穩定性、色澤和風味，也可以提供有關其來源以及加工和陳化工藝的信息[1]。因此，對食醋中有機酸構成和含量的準確了解可以為研究食醋生產工藝對其質量的影響提供理論依據，能夠為食醋工業化生產和制造工藝標準化的推進提供參考。

食醋中低分子質量的有機酸分子極性強，雖然用滴定法定量總酸度相當容易，但由于食醋基質復雜，代謝產物種類繁多，大量的氨基酸、糖類和酚類化合物以及色素、鞣質、無機鹽等的存在干擾分離和定量步驟，使對食醋中的單酸進行提取和測定有一定的難度。值得注意的是，我國在食醋中有機酸的含量測定方面缺乏官方統一的分析方法。GB 2719—2018《食醋》僅規定總酸（以乙酸計）質量濃度應不小于3.5 g/100 mL，而GB 5009.157—2016《食品中有機酸的測定》的適用范圍不包括食醋。目前，關于食醋中有機酸的分析方法有很多文獻報道，包括液相色譜（liquid chromatography，LC）法[10-19]、毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）法[19]、氣相色譜和氣相色譜-質譜法[20-22]、離子色譜（ion chromatography，IC）法[23]和光譜法[24]。其中以分析速度快、靈敏度高、穩定性好、應用范圍廣的LC法對食醋中有機酸分離分析的研究報道最多。文獻報道的LC法[10-16]對有機酸的分析均采用C18色譜分離柱結合紫外檢測的方法。樣品預處理方法可分為2 種，第1種只對樣品進行稀釋和過濾，第2種是樣品用離子交換樹脂或固相萃取柱萃?。ㄈ鏢AX陰離子交換萃取柱）以避免糖或色素與有機酸共溶的干擾，研究證實經稀釋過濾后直接進樣比固相萃取法具有更好的精密度和回收率[25]；余永健等[12-13]對采用C18色譜柱分離固態發酵食醋中9 種有機酸的LC分析法進行了優化；王潔等[17]采用Grace以樹脂聚合物為填料的有機酸專用分析柱對醋粉中的12 種有機酸進行分離；Lin等[18]使用Rezex ROA苯乙烯和二乙烯基苯聚合樹脂（苯環有8%被磺化）填料的分析柱成功分離了20 種有機酸；Castro等[19]采用Ion 300離子排阻色譜柱對5 種有機酸進行了分析。這些研究證明色譜柱的性能對分離復雜基質中的多種有機酸至關重要。

本研究建立離子色譜法測定鎮江香醋及其相關產品中乳酸、乙酸、丙酸、甲酸、丁酸、丙酮酸、異戊酸、戊酸、己二酸、丁二酸、酒石酸、酮戊二酸、草酸和檸檬酸的分析方法。采用Dionex Ion Pac AS11-HC分析柱（4 mm×250 mm）和KOH溶液梯度洗脫對上述14 種有機酸進行分離，電導檢測器進行檢測，方法準確性好、靈敏度高，適用于食醋及其相關衍生產品中14 種有機酸的測定。該方法為監控食醋生產過程和相關產品中的有機酸含量提供技術手段，有益于食醋產品的質量控制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鎮江香醋及制品由江蘇恒順醋業股份有限公司提供。超純水為美國Milli-Q Advantage A10超純水系統制備。

L-乳酸（≥98%） 大連美侖生物技術有限公司；甲酸鈉（≥99.0%） 美國Alfa Aesar公司；乙酸鈉（≥99.0%）、己二酸（≥99.5%）、丁二酸鈉（≥98%）、丙酮酸鈉（≥99.0%）和酮戊二酸（≥99.0%） 美國Sigma-Aldrich公司；戊酸（≥99.3%）、草酸（≥99.8%） 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；丁酸（≥99.0%）、丙酸（≥99.0%）上海麥克林生化科技有限公司；異戊酸（≥99.6%）北京世紀奧科生物技術有限公司；L-酒石酸（≥98.0%）北京索萊寶科技有限公司；檸檬酸（≥97.0%） 中國食品藥品檢定研究院。

1.2 儀器與設備

Dionex ICS-5000＋離子色譜儀（配有AS-AP智能樣品處理系統、自動淋洗液發生器和抑制電導檢測器，抑制器型號AERS 500_4mm）和Chromeleon 7.1色譜數據處理系統、Dionex OnGuardTMII RP Cartridges（1 mL）固相萃取柱、Dionex Ion Pac AS11-HC分析柱（4 mm×250 mm）、Dionex Ion Pac AS11-HC保護柱（4 mm×50 mm） 美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司；CF16RX高速冷凍離心機 日本Hitachi公司；KQ5200DE型數控超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；MX-F渦旋混合器 北京聯合科儀科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理及標準溶液配制

準確稱取混合均勻的食醋樣品0.5 g至50 mL容量瓶中，加水40 mL左右，于35 ℃超聲10 min，充分溶解后冷卻至室溫，加水定容至刻度，混勻；樣品在8 000 r/min離心10 min后，取一定體積的上清液，過0.22 μm水相濾膜，濾液備用（根據含量確定樣品稀釋倍數）；對于顏色較深的樣品，濾液可以采用Dionex OnGuardTMII RP Cartridges（1 mL）固相萃取柱進行凈化處理（凈化柱使用前依次用4 mL甲醇，6 mL水進行活化，放置30 min后使用）。將上述濾液通過凈化柱，棄去前面3 倍柱體積洗脫液，收集后面的洗脫液待上機測定。

分別準確稱取乳酸、乙酸鈉、丙酸、甲酸鈉、丁酸、丙酮酸鈉、異戊酸、戊酸、己二酸、丁二酸鈉、酒石酸、酮戊二酸、草酸和檸檬酸標準品約0.01 g（精確至0.01 mg）于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容，混勻。儲備液質量濃度均為1 000 μg/mL。分別吸取一定體積的上述14 種有機酸儲備溶液于容量瓶中，用水配制成100 μg/mL的標準混合溶液。

1.3.2 色譜條件

Dionex Ion Pac AS11-HC分析柱（4 mm×250 mm）和Dionex Ion Pac AS11-HC保護柱（4 mm×50 mm）；流動相：KOH梯度洗脫，流動相梯度見表1；流速1.5 mL/min；進樣量25 μL；檢測器：電導檢測器；抑制器：AERS500（4 mm）；抑制器電流167 mA。根據保留時間定性化合物，使用外標法根據峰面積定量。

表1 流動相梯度Table 1 Elution gradient of mobile phase

1.3.3 標準曲線的繪制

分別吸取一定體積的100 μg/mL標準混合溶液于容量瓶中，用水配制成0、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10.0 μg/mL的混合標準系列工作溶液。按照1.3.2節的色譜條件進行分析，以有機酸的質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）作圖，進行線性回歸分析和樣品定量分析。

1.3.4 樣品加標回收率的測定

準確稱取0.5 g白醋樣品18 份，1～6號樣品加入2 500 μg的有機酸，7～12號樣品加入5 000 μg的有機酸，13～18號樣品加入25 000 μg的有機酸，按照1.3.1節方法進行樣品的預處理，再按照1.3.2節色譜條件測定，計算回收率。

1.4 數據處理

運用Origin 8.6軟件進行圖形繪制，采用Chromeleon 7.1色譜數據處理系統進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 流動相梯度的優化

離子色譜是基于離子色譜柱（離子交換樹脂）上可離解的離子與流動相中具有相同電荷的溶質離子之間進行的可逆交換和分析物溶質對交換劑親和力的差別而被分離的。由于在溶液中大多數電離物質都會電離，因此可以通過測定電導值檢測被測物質的含量。本研究采用低選擇性的KOH淋洗液[26]和AS11-HC陰離子分離柱，樣品測試溶液進樣之后，有機酸陰離子首先與分離柱的離子交換位點之間直接進行離子交換（即被保留在柱上），然后被淋洗液中的OH-置換并從柱上被洗脫，對樹脂親和力弱的分析物離子先于對樹脂親和力強的分析物離子依次被洗脫。乳酸、乙酸、丙酸、甲酸、丁酸、丙酮酸、異戊酸、戊酸、己二酸、丁二酸、酒石酸、酮戊二酸、草酸、檸檬酸在稀溶液中會完全電離，產生電導，采用電導檢測器可以分析其含量。

考察KOH淋洗液質量濃度變化對14 種有機酸分離的影響。經過淋洗液質量濃度、分離時間的優化和分離效果的比較，確定的淋洗液梯度見表1。在優化后的色譜條件下，35 min內可以實現14 種有機酸的完全分離，如圖1所示。14 種有機酸完全達到基線分離。

圖1 有機酸標準溶液色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution of organic acids

2.2 樣品處理方法的選擇

圖2 樣品測試液色譜圖Fig.2 Chromatograms of tested samples

采用樣品直接稀釋的方法對食醋樣品進行處理。食醋發酵過程中微生物的代謝不僅產生多種低分子質量的有機酸，還產生了一些其他的大分子化合物，如肽類和多糖類化合物[27-28]。因此，在處理過程中采用高速離心的方式去除一些高分子質量化合物可以避免它們對測定過程的干擾。另外，樣品所含的有機酸中，乳酸和乙酸的含量遠高于其他的有機酸（如丁二酸和檸檬酸等），為了能夠準確定量，根據樣品中乙酸的含量將其稀釋不同的倍數測定，用稀釋倍數大的測試樣品對乳酸和乙酸進行定量（如稀釋50 倍或100 倍等），用稀釋倍數?。ㄈ缦♂?0 倍或10 倍等）的測試樣品對其他有機酸進行定量。對稀釋后顏色仍然較深的樣品，可以采用Dionex OnGuardTMII RP Cartridges（1 mL）固相萃取柱去除其中的色素。

如圖2A所示，16.543 min為Cl-的色譜峰，31.921 min為PO43-的色譜峰。如圖2B所示，樣品稀釋倍數為10 倍時，乳酸和乙酸色譜峰分離度差，峰形變差，定量準確性差，而稀釋倍數為50 倍的測試樣品乳酸和乙酸色譜峰分離度好，定量準確性高。

2.3 標準曲線的線性范圍和精密度結果

分別將不同質量濃度的有機酸標準溶液進行測定，得到標準溶液色譜圖（圖1）。以有機酸質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標作圖，線性回歸方程見表2。有機酸的質量濃度與峰面積具有良好的相關性。以10 μg/mL有機酸標準溶液連續重復進樣8 次進行精密度實驗，14 種有機酸測定結果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）結果在0.015%～0.032%范圍內，表明精密度滿足方法學定量的要求。根據GB/T 27417—2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》對檢出限和定量限的規定，以3 倍的信噪比確定檢出限（0.001～0.09 μg/mL），以10 倍的信噪比確定定量限（0.005～0.3 μg/mL），結果見表2。

2.4 方法的準確度和重復性結果

對方法的準確性進行考察，選擇白醋樣品進行加標回收實驗，白醋樣品中僅含有乙酸4.7%。在優化后的實驗條件下，分別對有機酸添加量為2 500、5 000 μg和25 000 μg的樣品進行測定，樣品前處理方式采用直接稀釋的方式，見表3，將有機酸添加量為25 000 μg的樣品稀釋后采用固相萃取柱凈化，見表4。圖3為白醋樣品本底和加標樣品的色譜圖。不使用固相萃取柱凈化時，14 種有機酸的平均回收率為94.7%～105%；使用萃取柱凈化時，丙酸的回收率為72.6%，丁酸的回收率只有1.1%，異戊酸和戊酸的回收率為0%，即短鏈脂肪酸的回收率隨碳原子數的增加而降低。

表3 直接稀釋的預處理方式回收率實驗結果Table 3 Recoveries with direct dilution pretreatment

表4 樣品稀釋后采用固相萃取柱凈化回收率實驗結果Table 4 Recoveries with sample dilution followed by solid phase extraction cleanup

圖3 樣品和加標樣品色譜圖Fig.3 Chromatograms of samples and spiked samples

2.5 樣品中有機酸含量

表5 樣品中有機酸含量Table 5 Contents of organic acids in real samples%

醋膏及醋粉均為鎮江香醋的加工制品，其中醋膏由鎮江香醋采用真空濃縮而成，醋粉則是由鎮江香醋添加麥芽糊精等輔料后，經過噴霧干燥而得的產品。由表5可知，鎮江香醋、醋膏及醋粉中檢出的有機酸種類一致，醋膏中乳酸質量分數高達10.1%，說明乳酸作為醋中含量比較穩定的有機酸，經過濃縮后，含量顯著升高。本方法適用于食醋及其加工衍生品中有機酸的測定。

3 結 論

分析影響食醋風味品質的有機酸構成和含量對產品品質評價和質量提升意義重大。本研究建立測定食醋及其相關產品中有機酸的離子色譜法。采用AS11-HC陰離子色譜柱分離，以KOH溶液梯度淋洗的方式對食醋中包括乳酸、乙酸、丙酸、甲酸、丁酸、丙酮酸、異戊酸、戊酸、己二酸、丁二酸、酒石酸、酮戊二酸、草酸和檸檬酸的14 種有機酸進行分離，流動相流速1.5 mL/min，電導檢測器進行檢測。方法重復測定結果的相對標準偏差均小于3%，直接稀釋法回收率在94.7%～105%范圍內，檢出限為0.001～0.09 μg/mL，定量限為0.005～0.3 μg/mL。方法學驗證結果表明，該分析方法具有特異性強、靈敏度高、準確性好等優點，樣品處理也比較簡便，適用于食醋及其相關制品中14 種有機酸的含量測定，可以作為有效控制食醋及相關產品質量的依據，為相關產品的品質評價、標準的完善和提升提供了技術支撐。