UPLC-PDA-MS-ABTS陽離子自由基在線分析藤茶的抗氧化活性成分

甘小娜，彭 博，李廷釗，李 波,

（1.安利（中國）研發中心，上海 201203；2.安利（中國）植物研發中心，江蘇 無錫 214145）

藤茶，亦稱銀茶、霉茶，是葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄的干燥莖葉，為多年生藤本植物，主要分布于長江流域，如湖北恩施、湖南張家界和衡陽、貴州梵凈山、福建武夷山等地[1]。藤茶在我國民間（尤其是少數民族地區）應用歷史悠久，是土家族藥用珍品，也是客家的民俗茶飲，還是瑤族的傳統浴波植物之一，在拉祜族、侗族、基諾族等少數民族中均有廣泛應用，用以治療口腔潰瘍、咽炎，以及胃腸不適癥等[2]。藤茶中富含黃酮類化合物，占干制樣品的40%[3]，其中又以二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）含量最為突出[4]。現代藥理研究藤茶具多種功效，如抗氧化[5-6]、抗菌抗炎[7]、降血脂[8]、護肝解酒[9]、保護心臟[10]、抗腫瘤[11]等。2013年12月24日，國家衛生計生委批準顯齒蛇葡萄葉為新資源食品；作為茶藥兩用植物資源，藤茶開發潛力巨大。

常規活性成分的篩選是將原植物進行提取、分離并鑒定后，再針對單體化合物進行活性測定，該方法費時費力，且原藥材用量較大；近年來，國內外有不少學者對該方法進行改進，將活性分析（如抗氧化劑[12-15]、乙酰膽堿酯酶抑制劑[16]、α-葡萄糖苷酶抑制劑[17]、肝細胞色素P450配體[18]、磷酸二酯酶抑制劑[19]、血管緊張素轉換酶抑制劑[20]等）和現代分析儀器設備結合起來，在進行化學成分分析的同時完成化合物活性篩選和鑒定，大大提高了天然植物活性化合物篩選和鑒定的效率。但目前發表的抗氧化活性篩選相關文獻基本都是將活性分析與普通高效液相色譜儀結合，鮮見有超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）[21]在線抗氧化方法的運用；UPLC分析速度快、分離度好，可在很大程度上縮短實驗時間、提高實驗效率，其在分析領域的應用，尤其對不穩定物質的快速分析，有其不可替代的優勢。

本實驗旨在利用在線活性分析的方法，采用液相色譜-質譜聯用的手段，獲得化合物的保留時間、紫外吸收圖譜及相對分子質量信息，對比文獻對化合物進行初步推斷，并結合已有標準品對推斷的結論進一步驗證，從而鑒定藤茶中主要的抗氧化成分；建立UPLC-二極管陣列檢測器-質譜-2,2’-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（UPLC-photo-diode array-mass spectrometry-2,2’-amino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)ammonium salt，UPLC-PDA-MS-ABTS）陽離子自由基藤茶抗氧化活性的定量方法，并分析比較不同產地藤茶抗氧化活性的高低，以期為后續質量標準的建立提供物質基礎，同時也為UPLC串聯在線抗氧化活性測定提供參考方法和實驗條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Merck公司；乙醇（分析純） 中國General-Reagent公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 美國Thermo Fisher Scientific公司；甲酸（色譜純） 美國Honeywell公司；ABTS、過硫酸鉀（K2(SO4)2）、Trolox中國Adamas Reagent公司；超純水由美國Milli-Q超純水機制備；DMY、楊梅素-3-O-鼠李糖苷、楊梅素深圳振強生物技術有限公司；藤茶藥材由安利（中國）研發中心陳亮博士鑒定，并存樣于藥材庫，其產地及來源見表1。

表1 藤茶產地及來源信息Table 1 Information about vine tea samples used in this study

1.2 儀器與設備

Milli-Q超純水系統 上海技舟化工科技有限公司；WF-600EHT型超聲波清洗機 寧波海曙五方超聲設備有限公司；TU-1900雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；XS2051/10萬分之一電子天平、MS3002S型電子分析天平 梅特勒-托利多國際貿易有限公司；UPLC儀（配PDA檢測器、串聯QDa質譜儀） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 藤茶中化合物的鑒別與在線抗氧化活性篩選

1.3.1.1 供試品溶液的制備

取藤茶粉末約100 mg，精密稱質量，置于50 mL容量瓶中，加60%乙醇溶液定容至刻度線，超聲提取30 min，以0.22 μm有機濾膜過濾，取續濾液，待測。

1.3.1.2 ABTS溶液的制備[22]

精密稱取ABTS粉末約50 mg，加適量PBS溶解；精密稱取過硫酸鉀粉末約50 mg，加入10 mL PBS溶解；取適量過硫酸鉀溶液加入ABTS溶液中，混勻，使ABTS終濃度為3.6 nmol/L，過硫酸鉀終濃度為1.2 nmol/L；室溫避光反應過夜（12～16 h），于4 ℃保存備用，自由基溶液有效期為2 d，使用時用PBS調節至所需吸光度（729 nm波長處吸光度為0.7±0.02）。

1.3.1.3 藤茶中化合物的鑒別與在線抗氧化活性篩選流程

UPLC-PDA-MS-ABTS陽離子自由基在線鑒別藤茶中的抗氧化成分裝置流程見圖1。路徑A：供試品溶液經色譜柱分離后，進入柱后反應模塊，與柱后反應體系泵入的PBS混合后先后流經PDA和質譜，即可得到化合物在290 nm波長處的正吸收峰圖及質譜圖，根據質譜得到的化合物分子質量信息并結合文獻數據，即可初步推斷供試品中化合物的結構。路徑B：將柱后體系中的溶劑置換成ABTS溶液，并設置PDA檢測波長為729 nm，以相同的條件進樣，供試品溶液經分離后與柱后反應體系泵入的ABTS溶液混合并反應后進入PDA，即可得到由于自由基的清除作用而形成的負吸收峰。

圖1 在線檢測藤茶抗氧化成分示意圖Fig.1 Schematics of UPLC-PDA-MS (A) and UPLC-PDA-ABTS cation radical (B) for screening and identification of antioxidants in vine tea

1.3.1.4 藤茶中化合物的鑒別與在線抗氧化活性篩選條件

UPLC條件：色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相：0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～2.5 min，90% A，10% B；1.5～6 min，90%～10%A，10%～90% B；6～8 min；10% A，90% B；8～10 min，10%～100% A，90%～0% B；流速：0.4 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：290 nm/729 nm（具體設置見1.3.1.3節）；進樣量：1 μL。

質譜條件：離子源：電噴霧離子源，負離子檢測模式；霧化氣：氮氣；錐孔電壓：15 V；質量掃描范圍：m/z100～800。

柱后反應系統條件：反應環體積：1 mL；流動相：ABTS陽離子自由基溶液（729 nm波長處吸光度為0.7±0.02）；流速：0.4 mL/min，柱后反應模塊溫度：37 ℃。

1.3.2 藤茶中DMY的含量測定

采用標準曲線法，以DMY為標準品，通過其質量濃度與峰面積之間的關系，對藤茶中DMY進行定量分析。

1.3.2.1 標準品溶液的制備

取DMY標準品約5 mg，精密稱定，置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度線，充分搖勻，備用。

1.3.2.2 供試品溶液的制備

取藤茶粉末約80 mg，精密稱質量，置于250 mL容量瓶中，加60%乙醇溶液200 mL，超聲提取30 min，再加60%乙醇溶液定容至刻度線，充分混勻，以0.22 μm有機濾膜過濾，取續濾液，待測。

1.3.2.3 儀器工作條件

設備連接見1.3.1節，選用路徑A，斷開質譜連接；超高效液相系統及柱后反應體系其他條件同1.3.1.4節，檢測波長選用290 nm，柱后反應系統的流動相選用PBS。

1.3.3 藤茶的抗氧化活性定量分析

以Trolox為標準品，采用標準曲線法，對其中DMY的抗氧化活性進行分析；其活性用Trolox當量抗氧化能力（trolox-equivalent antioxidant capacity，TEAC）評價，按下式[23]進行計算：

式中：Y=kX＋b為Trolox的濃度與倒峰面積標準曲線方程；A為供試品中DMY的倒峰面積；b為標準曲線方程的截距；V為供試品的體積；k為標準曲線方程的斜率；M為供試品的質量。

1.3.3.1 標準品溶液的制備

取Trolox標準品約5 mg，精密稱定，置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度線，充分搖勻，備用。

1.3.3.2 供試品溶液的制備

同1.3.2.2節。

1.3.3.3 儀器工作條件

設備連接見1.3.1節，選用路徑B；UPLC系統及柱后反應體系其他條件同1.3.1.4節，檢測波長選用729 nm，柱后反應系統的流動相選用ABTS溶液。

1.4 數據采集及分析

采用Empower 3FR3和Excel 2016軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 系統方法的優化

2.1.1 ABTS陽離子自由基最大波長的選擇

ABTS陽離子自由基波長大概分布在410、645、730 nm三個波長附近[24-28]，本實驗對自由基的吸收光譜從300～800 nm掃描；取ABTS儲備液適量，加40 倍體積的PBS溶液，稀釋，搖勻，用紫外-可見分光光度儀進行掃描，結果與文獻一致，ABTS陽離子自由基在413、645、729 nm波長處達到吸收峰值，為盡量減小干擾，本實驗最終選擇729 nm作為ABTS陽離子自由基的測定波長。

2.1.2 流動相的選擇

本實驗比較甲醇和乙腈兩種有機相對出峰的影響，結果表明，藤茶提取物在兩種有機相下均能獲得較好的峰形，但以甲醇為有機相時，Trolox出峰較晚且基線漂移較大，故本實驗選擇乙腈為實驗的有機相；水相考察純水、0.1%甲酸、0.1%乙酸的影響，結果表明流動相中添加少量甲酸和添加少量乙酸的效果相當，相對于用純水作為流動相，加入少量酸能獲得更好的峰形，并改善DMY與鄰峰之間的分離度，本實驗最終選擇甲酸作為流動相添加劑。

2.1.3 UPLC系統流速及柱后反應系統流速的選擇

整個系統流速的選擇是影響實驗的關鍵因素。在相同梯度條件下，UPLC系統流速過低會導致出峰延遲且影響分離度。柱后反應系統流速過低時，圖譜噪音基線提高，且色譜峰展寬明顯；而當柱后部分流速過大時，負吸收峰的面積逐漸減小，反應程度呈下降的趨勢。因此，為兼顧化合物的分離度、峰形和實驗的反應程度，本實驗通過設置不同的流速進行比較，最終選擇液相系統流速和柱后反應系統流速均為0.4 mL/min。

2.1.4 柱溫的選擇

實驗比較柱溫在25、30、35、40 ℃出峰情況，結果表明，溫度越高，化合物出峰越早，分離度越差；在25 ℃，化合物的保留及分離度均能達到較好狀態。

2.2 抗氧化成分的鑒定

圖2 Trolox色譜圖（a）、藤茶樣本原色譜圖（b）、在線ABTS色譜圖（c）及負離子模式下提取離子流圖（d）Fig.2 Liquid chromatograms of Trolox (a) and vine tea (b), on-line ABTS assay chromatogram (c) and extracted ion chromatogram in negative ion mode (d)

取供試品溶液按優化條件進行分析，得到藤茶提取液原色譜圖、在線ABTS色譜圖及負離子模式下提取離子流圖（圖2）。分別對其中的質譜峰進行分析，得化合物1的分子離子峰[M－H]－的m/z為319.16，化合物2的分子離子峰[M―H]-的m/z為319.13，化合物3的分子離子峰[M―H]-的m/z為463.24，化合物4的分子離子峰[M-H]-的m/z為316.97。根據化合物的紫外吸收、保留時間及分子質量信息，結合文獻[29-30]初步推斷化合物1為DMY，化合物2為異二氫楊梅素，化合物3為楊梅素-3-O-鼠李糖苷，化合物4為楊梅素；取標準品溶液，以相同色譜條件進樣，標準品溶液與所推斷化合物在相同時間出峰，進一步證明推斷正確。由圖2可知，以上4 個化合物均有不同程度的抗氧化活性，其中主要抗氧化成分為DMY。

2.3 DMY含量測定方法學考察

2.3.1 線性關系考察

取DMY標準品溶液，加甲醇配制成質量濃度為0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5 mg/mL的標準曲線溶液，按1.3.1.4節方法進行測定，以質量濃度為橫坐標，以DMY峰面積為縱坐標，進行線性回歸，回歸方程為Y=6 675 318.17X-11 262.08，R2=1.000，表明DMY在0.01～0.5 mg/mL之間線性關系良好。

2.3.2 精密度實驗

精密吸取質量濃度為0.1 mg/mL的對照品溶液1 μL，連續進樣6 次，記錄DMY的峰面積，其RSD為0.43%，說明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性實驗

取同一樣品6 份，按1.3.2.2節和1.3.2.3節處理并進行測定，記錄峰面積并計算其相對含量，結果平均值為40.8%，RSD為0.78%，表明方法重復性良好。

2.3.4 穩定性實驗

取供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、12、24 h進樣，每次1 μL，結果表明DMY峰面積在24 h內變化很小，RSD為1.59%，表明供試品在室溫（25 ℃）24 h內穩定性良好。

2.3.5 加樣回收率實驗

取藤茶粉末適量于250 mL容量瓶，加入標準品粉末，按1.3.2.2節方法制備藤茶樣本并進樣，計算其回收率，結果見表2。

表2 DMY在藤茶樣品中的加樣回收率Table 2 Recovery of DMY in spiked vine tea

2.4 活性定量方法學考察結果

2.4.1 線性關系考察結果

取Trolox標準品溶液，加甲醇配制成質量濃度為0.02、0.04、0.10、0.20、0.40 mg/mL的標準曲線溶液，按1.3.1.4方法進行測定，以質量濃度為橫坐標，以倒峰面積為縱坐標，進行線性回歸，回歸方程為Y＝6 366 664.72X＋13 021.76，R2＝0.999，表明Trolox在0.02～0.4 mg/mL線性關系良好。

2.4.2 精密度實驗

取Trolox和DMY標準品，配制成兩者均為0.1 mg/mL的混合標準品溶液，進樣。精密吸取同一對照品溶液1 μL，連續進樣6 次，測定Trolox和DMY的峰面積，其RSD分別為0.39%和0.54%，說明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性實驗

取同一樣品6 份，按1.3.2.2節和1.3.2.3節處理并進行測定，記錄峰面積，計算TEAC值，結果平均值為0.41，RSD為0.19%，表明方法重復性良好。

2.4.4 穩定性實驗

取供試品溶液，分別于0、0.5、1、2、5、10 h進樣，每次1 μL，結果DMY倒峰峰面積在10 h內變化很小，RSD為1.91%，表明供試品在室溫（25 ℃）10 h內穩定性良好，也說明所配制的ABTS陽離子自由基在10 h內可對樣品進行穩定測定。

2.5 樣品測定結果

取藤茶藥材粉末80 mg，精密稱定，按1.3.2.2節方法制備，吸取供試品溶液1 μL，依法測定倒峰面積，按標準曲線法計算TEAC值，結果見表3。

由表3可知，不同產地來源的藤茶抗氧化能力差異較大，其中來源于湖北恩施鳳硒藤茶有限公司（S7）和福建武夷山（S4）的樣本抗氧化能力最強。

表3 不同來源藤茶樣本DMY含量及抗氧化活性測定結果Table 3 Antioxidative capacities of vine tea samples from different sources

3 結 論

本研究采用UPLC-PDA-MS-ABTS陽離子自由基在線篩選藤茶中的抗氧化活性物質，推斷出主要抗氧化活性物質DMY，并以Trolox為標準物質，建立藤茶抗氧化活性分析的定量方法，對市場上來源不同的12 批藤茶樣本進行分析，來源于湖北恩施和福建武夷山的藤茶抗氧化效果較為突出。DMY既是藤茶含量最高的化合物，也是其抗氧化活性最好的成分，可作為其質量控制的指標。

將抗氧化活性數據與藤茶中DMY的含量數據進行比較分析，發現其含量與活性之間呈現良好的量效關系，也進一步證明了該定量方法對藤茶中DMY活性評估的可靠性。

本方法將UPLC與柱后反應系統相結合，利用UPLC分離效率高的優勢，可有效縮短分析時間，提高實驗效率；然而由于這兩套系統本身在管路設計上存在差異，對于成分復雜的提取物的活性定量具有較大的挑戰性，后期可嘗試對管路進行優化和改造，使該方法應用于更多復雜體系的分析。